Xem trước tài liệu

Đang tải tài liệu...

Thông tin chi tiết tài liệu

Định dạng: PDF
Số trang: 10 trang
Dung lượng: 146 KB

Giới thiệu nội dung

Probing the mechanism of the bifunctional enzyme ketol-acid reductoisomerase by site-directed mutagenesis of the active site

Tác giả: Rajiv Tyagi, Yu-Ting Lee, Luke W. Guddat, and Ronald G. Duggleby

Lĩnh vực: Biochemistry and Molecular Biology

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này khám phá cơ chế hoạt động của enzyme ketol-acid reductoisomerase (KARI), một enzyme hai chức năng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các axit amin chuỗi nhánh. Enzyme này xúc tác hai phản ứng khác biệt tại cùng một vị trí hoạt động: một phản ứng đồng phân hóa (isomerization) bao gồm sự di chuyển nhóm alkyl, tiếp theo là phản ứng khử 2-ketoacid phụ thuộc NADPH. Nghiên cứu sử dụng enzyme E. coli tái tổ hợp thuần khiết để cho thấy phản ứng đồng phân hóa có hằng số cân bằng không thuận lợi. Hoạt động khử của enzyme không đặc hiệu và có thể sử dụng nhiều loại 2-ketoacid. Vị trí hoạt động của enzyme chứa tám axit amin phân cực được bảo tồn, và các nhà nghiên cứu đã biến đổi từng axit amin này để phân tích đóng góp của chúng vào hoạt động đồng phân hóa và khử. Một số đột biến dẫn đến mất hoạt động đồng phân hóa trong khi vẫn giữ được hoạt động khử. Nghiên cứu đề xuất một lời giải thích mới về lý do tại sao cần có một vị trí hoạt động chung cho cả hai phản ứng, liên quan đến việc khử trực tiếp trạng thái chuyển tiếp hình thành trong quá trình đồng phân hóa.

Mục lục chi tiết:

  • Keywords
  • Correspondence
  • Abstract
  • Introduction
  • Results
  • Wildtype
  • Isomerase activity
  • Reductase activity
  • Mg2+ binding
  • NADPH binding
  • KARI mutants
  • Expression and purification
  • Activity assays
  • Catalytic properties
  • Discussion
  • Experimental procedures
  • Materials
  • Enzyme expression, purification and mutagenesis
  • Activity assays
  • Binding studies
  • Acknowledgements
  • References