Báo cáo khoa học: The 2-oxoacid dehydrogenase multi-enzyme complex of the archaeon Thermoplasma acidophilum ) recombinant expression, assembly and characterization

The 2-oxoacid dehydrogenase multi-enzyme complex of the archaeon Thermoplasma acidophilum – recombinant expression, assembly and characterization

Tác giả: Caroline Heath, Mareike G. Posner, Hans C. Aass, Abhishek Upadhyay, David J. Scott, David W. Hough, and Michael J. Danson

Lĩnh vực: Archaea; metabolism; multi-enzyme complex; 2-oxoacid dehydrogenase; thermophile

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này trình bày việc phân lập, biểu hiện và đặc tính hóa tổ hợp enzyme đa phức hợp 2-oxoacid dehydrogenase (OADHC) từ archaea ưa nhiệt Thermoplasma acidophilum. Các nhà nghiên cứu đã thành công trong việc biểu hiện các thành phần enzyme Ela, E1β, E2 và E3 trong E. coli và chứng minh rằng các enzyme tái tổ hợp này có thể lắp ráp thành một phức hợp đa enzyme lớn, có hoạt tính xúc tác. Phức hợp này có khả năng xúc tác quá trình decarboxyl hóa oxy hóa các 2-oxoacid mạch nhánh và pyruvate thành các dẫn xuất acyl-CoA tương ứng. Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng đầu tiên về sự tồn tại của một phức hợp 2-oxoacid dehydrogenase chức năng ở archaea, mở ra những hiểu biết mới về trao đổi chất trong sinh vật cổ đại này.

Mục lục chi tiết:

• Results
• Expression and purification of the E1, E2 and E3 components
• The E1 component
• The E2 component
• The E3 component
• Assembly of OADHC from the recombinant components
• Complex assembly
• OADHC activity
• Relative molecular mass of the E2 core and the assembled complex
• E2 core
• The assembled complex
• Discussion
• Experimental procedures
• Materials
• Bioinformatics
• Recombinant DNA techniques
• E2 and E3 gene amplification
• Construction of expression vectors pET28a-E2 and pET28a-E3
• Expression and purification of OADHC components
• E2 expression and purification
• E3 expression and purification
• Assembly of the OADHC multi-enzyme complex
• SDS-PAGE
• Enzyme assays
• Gel filtration
• Analytical ultracentrifugation
• Dynamic light scattering
• Mass spectrometry
• Determination of the E2 polypeptide mass
• Mapping the lipoylation of E2
• Acknowledgements
• References