Báo cáo khoa học: Tryptophan 243 affects interprotein contacts, cofactor binding and stability in D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis

Tryptophan 243 Affects Interprotein Contacts, Cofactor Binding and Stability in D-Amino Acid Oxidase from Rhodotorula Gracilis

Tác giả: Laura Caldinelli, Gianluca Molla, Mirella S. Pilone and Loredano Pollegioni

Lĩnh vực: Department of Biotechnology and Molecular Sciences, University of Insubria, Varese, Italy

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào vai trò của axit amin tryptophan tại vị trí 243 (Trp243) trong việc ảnh hưởng đến tương tác giữa các protein, khả năng gắn kết đồng yếu tố (cofactor) và độ ổn định của enzyme D-amino acid oxidase (DAAO) từ nấm men Rhodotorula gracilis. Các đột biến tại vị trí Trp243 được tạo ra để thay thế tryptophan bằng tyrosine hoặc isoleucine. Kết quả cho thấy các đột biến này không làm suy giảm đáng kể hoạt tính xúc tác nhưng lại làm thay đổi cấu trúc bậc ba, dẫn đến cấu trúc lỏng lẻo hơn và giảm độ ổn định dưới tác động của nhiệt độ và chất biến tính. Sự thay đổi cấu trúc này ảnh hưởng đến cả tương tác của coenzyme với apoprotein và tương tác giữa các đơn vị monomer. Nghiên cứu chỉ ra rằng Trp243 đóng vai trò quan trọng trong việc tối ưu hóa tương tác giữa các đơn vị monomer thông qua việc tăng cường tương tác van der Waals và loại trừ dung môi.

Mục lục chi tiết:

• Structural determinants for dimerization of DAAO
• Abstract
• Keywords
• Correspondence
• Introduction
• Results
• Spectral properties of Trp243 DAAO mutants
• Kinetic properties of Trp243 DAAO mutants
• Oligomerization state of Trp243 DAAO mutants
• Spectroscopic studies of thermal stability
• Urea-induced unfolding
• Effects of urea on the associative behaviour
• Kinetics of reconstitution of apoprotein with FAD
• Discussion
• Experimental procedures
• Mutagenesis, enzyme expression and purification, and apoprotein preparation
• Activity assay
• Size-exclusion chromatography
• Spectroscopy
• Acknowledgements
• References