Báo cáo khoa học: Replacement of two invariant serine residues in chorismate synthase provides evidence that a proton relay system is essential for intermediate formation and catalytic activity

Replacement of two invariant serine residues in chorismate synthase provides evidence that a proton relay system is essential for intermediate formation and catalytic activity

Tác giả: Gernot Rauch, Heidemarie Ehammer, Stephen Bornemann and Peter Macheroux

Lĩnh vực: Enzyme Mechanism, Shikimate Pathway, Site-directed Mutagenesis

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào enzyme Chorismate synthase, một thành phần quan trọng trong con đường shikimate, chịu trách nhiệm cho bước cuối cùng trong quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thơm. Bài báo trình bày kết quả của một nghiên cứu đột biến, trong đó hai chuỗi serine bất biến trong vị trí hoạt động của enzyme đã được thay thế bằng alanine. Các đột biến đơn lẻ (Ser16Ala và Ser127Ala) cho thấy hoạt tính giảm đáng kể, trong khi đột biến kép (Ser16AlaSer127Ala) gần như loại bỏ hoàn toàn hoạt tính xúc tác. Điều này gợi ý rằng hai chuỗi serine này, cùng với các phân tử nước lân cận, đóng vai trò thiết yếu trong việc hình thành một hệ thống truyền proton. Hệ thống này được cho là hỗ trợ sự hình thành các chất trung gian và quá trình xúc tác của enzyme, có thể thông qua việc điều chỉnh vị trí của FMN, histidine 106 và nhóm phosphate của cơ chất. Nghiên cứu cũng cung cấp bằng chứng cho thấy sự gián đoạn của hệ thống này ảnh hưởng đến sự hình thành các chất trung gian thoáng qua cần thiết cho phản ứng.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Chorismate synthase catalyzes the seventh and last step in the shikimate pathway
• Enzyme activity relies on reduced FMN
• Structural information of the enzyme
• Mutagenesis study
• Results
• Expression and purification of the Ser16Ala and Ser127Ala single-mutant proteins and of the Ser16AlaSer127Ala double-mutant protein
• Binding of oxidized FMN to the mutant proteins
• Binding of EPSP to the mutant proteins in the presence of oxidized FMN
• Intrinsic FMN:NADPH oxidoreductase activity of the mutant proteins
• Chorismate synthase activity of the serine mutant proteins
• Discussion
• Proposed proton relay system
• Experimental procedures
• Reagents
• Site-directed mutagenesis
• Production and purification of NCCS
• UV-visible absorbance spectrophotometry
• UV/visible difference absorbance spectrophotometry
• Activity assay under aerobic conditions
• Stopped-flow spectrophotometry
• Spectra of reaction intermediates
• Acknowledgements
• References