Báo cáo khoa học: Molecular cloning and characterization of methylenedioxy bridge-forming enzymes involved in stylopine biosynthesis in Eschscholzia californica

Molecular cloning and characterization of methylenedioxy bridge-forming enzymes involved in stylopine biosynthesis in Eschscholzia californica

Tên đề tài: Molecular cloning and characterization of methylenedioxy bridge-forming enzymes involved in stylopine biosynthesis in Eschscholzia californica

Tác giả: Nobuhiro Ikezawa, Kinuko Iwasa, and Fumihiko Sato

Lĩnh vực: Sinh hóa thực vật, enzyme, sinh tổng hợp alkaloid

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và mô tả các enzyme cytochrom P450 (CYP719A2 và CYP719A3) có vai trò trong quá trình sinh tổng hợp (S)-stylopine ở cây California poppy (Eschscholzia californica). Các enzyme này xúc tác cho phản ứng tạo cầu methylenedioxy, một bước quan trọng trong việc hình thành các alkaloid benzophenanthridine. Nghiên cứu đã chứng minh rằng cả hai enzyme CYP719A2 và CYP719A3 đều có hoạt tính stylopine synthase (STS), chuyển hóa cheilanthifoline thành stylopine. Tuy nhiên, chúng không thể thực hiện chức năng cheilanthifoline synthase (CHS) để chuyển scoulerine thành cheilanthifoline. Phân tích sâu hơn về đặc tính của enzyme cho thấy sự khác biệt về ái lực cơ chất giữa CYP719A2 và CYP719A3, với CYP719A2 có ái lực cao hơn với cheilanthifoline, trong khi CYP719A3 có ái lực với nhiều cơ chất hơn. Nghiên cứu cũng xem xét sự biểu hiện của các gen CYP719A2 và CYP719A3 trong các mô khác nhau của cây E. californica và phản ứng của chúng với methyl jasmonate, cho thấy sự điều hòa phối hợp trong quá trình sinh tổng hợp alkaloid.

Mục lục chi tiết:

• Abstract
• Introduction
• Results
• Isolation of cytochrome P450 cDNAs
• Nucleotide sequences and predicted amino acid sequences
• Heterologous expression of CYP719A2 and CYP719A3 in S. cerevisiae and their enzymological activities
• Measurement of P450 hemoprotein
• Assay of enzymatic activity
• P450 natures of CYP719A2 and CYP719A3
• Substrate specificity and affinity of CYP719A2 and CYP719A3
• Expression of CYP719A2 and CYP719A3 genes in E. californica plants: tissue specificity and their response to methyl jasmonate (MeJA)
• Discussion
• Experimental procedures
• Plant materials
• Chemicals
• Amplification of cytochrome P450 cDNA fragments from single-stranded cDNAs of cultured E. californica cells
• Cloning of full-length cDNAs
• Alignment analysis
• Construction of S. cerevisiae expression vectors
• Heterologous expression of CYP719A2 and CYP719A3 in S. cerevisiae
• Measurement of P450 hemoprotein
• Assay of enzymatic activity
• Quantitative RT-PCR
• Acknowledgements
• References