Báo cáo khoa học: Mediator is required for activated transcription in a Schizosaccharomyces pombe in vitro system

Mediator is required for activated transcription in a Schizosaccharomyces pombe in vitro system

Tên đề tài: Mediator is required for activated transcription in a Schizosaccharomyces pombe in vitro system

Tác giả: Evelyn Tamayo, Giuliano Bernal, Ursula Teno, Edio Maldonado

Lĩnh vực: Sinh học tế bào và phân tử, Khoa học Y sinh

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này mô tả một hệ thống phiên mã in vitro được tái tạo từ nấm men Schizosaccharomyces pombe, bao gồm RNA polymerase II (RNAPII) được tinh chế ái lực, TFIIH được tinh chế cao, và các yếu tố phiên mã chung (GTFs) tái tổ hợp như TBP, TFIIB, TFIIE, và TFIIF. Hệ thống này có khả năng hỗ trợ phiên mã cơ bản từ promoter adenovirus major late (Ad-MLP) khi chỉ sử dụng RNAPII tinh chế. Quan trọng hơn, hệ thống này cho thấy phiên mã được kích hoạt khi bao gồm phức hợp RNAPII holoenzyme, bao gồm cả các protein Mediator. Các yếu tố liên kết TATA (TBP) kết hợp với các yếu tố liên quan có TBP (TAFs) không ảnh hưởng đến sự kích hoạt phiên mã trong hệ thống Sc. pombe này. Kết quả chỉ ra rằng Sc. pombe sử dụng cùng bộ GTFs như các sinh vật nhân chuẩn khác và Mediator đóng vai trò thiết yếu trong phiên mã được kích hoạt.

Mục lục chi tiết:

• Mediator is required for activated transcription in a Schizosaccharomyces pombe in vitro system
• RNA polymerase II (RNAPII) requires a set of general transcription factors – TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF and TFIIH – to initiate transcription from a gene promoter in vitro.
• The ability to achieve basal levels of transcription from protein-encoding genes in eukaryotes requires RNA polymerase II (RNAPII) and a set of additional proteins called general transcription factors (GTFs).
• Mediator is a large multiprotein complex that is brought to promoters by DNA-bound, gene-specific transcriptional regulatory proteins and helps these proteins to communicate with factors bound to the core promoter.
• The yeast Schizosaccharomyces pombe can be genetically manipulated and has served as an excellent model for the study of cell division cycle control and DNA repair and recombination.
• Materials and methods
• Cloning of Sc. pombe TFIIE, TFIIF, TFIIB and the p52 subunit of TFIIH
• Expression and purification of Sc. pombe TFIIE, TFIIF, TFIIB, TBP and the Tfb1 subunit of TFIIH
• Purification of TFIIH, RNAPII and the RNAPII holoenzyme
• Purification of the TFIID complex
• Purification of the Gal4 DNA binding domain, Gal4-AP2, Gal4-VP16 and GAL4-CTF
• Preparation of antibodies to TFIIFẞ, Srb4, Tfb1, TAF110, and TAF72
• Specific transcription reactions
• Purification of DNA templates
• Results
• Identification and purification of TFIIE, TFIIF, TFIIB, TBP and the Tfb1 subunit from Sc. pombe
• Purification of RNAPII and RNAPII holoenzyme from Sc. pombe
• Reconstitution of transcription in vitro using purified recombinant factors from Sc. pombe
• The RNAPII holoenzyme stimulates basal and activated transcription in a reconstituted transcription system
• Antibodies against Srb4 inhibit activated but not basal transcription
• The TAF-containing complex does not have an effect on activated transcription
• Discussion
• Acknowledgements
• References