Báo cáo khóa học: Effects of Escherichia coli ribosomal protein S12 mutations on cell-free protein synthesis

Effects of Escherichia coli ribosomal protein S12 mutations on cell-free protein synthesis

Tác giả: Namthip Chumpolkulwong, Chie Hori-Takemoto, Takeshi Hosaka, Takashi Inaoka, Takanori Kigawa, Mikako Shirouzu, Kozo Ochi, Shigeyuki Yokoyama
Lĩnh vực: Sinh học phân tử, Vi sinh vật học
Nội dung tài liệu:
Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của các đột biến trên protein S12 ribosome của vi khuẩn Escherichia coli đến hiệu quả tổng hợp protein trong hệ thống không tế bào. Bảy chủng đột biến kháng streptomycin và hai chủng phụ thuộc streptomycin đã được phân lập từ E. coli BL21. Các đột biến tập trung tại các vị trí Lys42, Lys87, Pro90 và Gly91 của protein S12 ribosome. Các chủng đột biến này đã được sử dụng để chuẩn bị dịch chiết S30 cho hệ thống tổng hợp protein không tế bào. Nghiên cứu so sánh hoạt tính tổng hợp protein của các chủng đột biến với chủng hoang dã, đặc biệt là khả năng tổng hợp chloramphenicol acetyltransferase (CAT). Kết quả cho thấy chủng đột biến K42T thể hiện hoạt tính cao hơn chủng hoang dã, với năng suất protein tăng 1.3 lần. Các chủng đột biến khác tại Lys42 (K42R, K42N, K42I) lại cho thấy hoạt tính thấp hơn. Nghiên cứu cũng đánh giá tần số sai sót trong quá trình tổng hợp phenylalanine, cho thấy hầu hết các chủng đột biến đều có độ chính xác cao hơn và hoạt tính thấp hơn chủng hoang dã, ngoại trừ K42T vẫn duy trì hoạt tính cao đi kèm với độ chính xác cao. Khi sử dụng các khuôn mẫu cDNA của chuột, hệ thống K42T cũng cho thấy năng suất protein tăng 1.2-2 lần so với chủng hoang dã.
Mục lục chi tiết:
– Introduction
– Materials and methods
– Preparation of rpsl mutants
– Mutation analysis of rpsL
– Bacterial strains and culture conditions
– S30 preparation
– Cell-free translation
– Error frequency assay in the in vitro translation
– Results
– Growth characteristics of S12 mutants
– Cell-free CAT protein synthesis with the extract from each strain
– Comparison of the optimum concentration conditions between the wild-type and K42T systems
– Cell-free protein synthesis with mouse cDNA templates
– Translation properties
– Discussion
– Acknowledgements
– References