Báo cáo khoa học: Factors influencing RNA degradation by Thermus thermophilus polynucleotide phosphorylase

Factors Influencing RNA Degradation by Thermus Thermophilus Polynucleotide Phosphorylase

Tác giả: Marina V. Falaleeva, Helena V. Chetverina, Victor I. Ugarov, Elena A. Uzlova and Alexander B. Chetverin

Lĩnh vực: Sinh học phân tử, Hóa sinh

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và đặc tính hóa Thermus thermophilus polynucleotide phosphorylase (Tth PNPase), một enzyme có khả năng phân hủy RNA. Khác với các PNPase từ sinh vật ưa ấm, Tth PNPase hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ cao, có thể phân hủy hoàn toàn các RNA có cấu trúc thứ cấp phức tạp mà các enzyme khác không xử lý được. Nghiên cứu cũng khám phá khả năng bảo vệ RNA khỏi sự phân hủy bởi Tth PNPase thông qua các sửa đổi ở đầu 3′ hoặc bằng cách lai ghép với các oligonucleotide. Các đặc tính này cho thấy Tth PNPase có tiềm năng ứng dụng trong các quy trình nghiên cứu và thực tiễn yêu cầu sự phân hủy RNA được kiểm soát.

Mục lục chi tiết:

• Results
• Conditions optimal for exonuclease activity
• Selective protection of RNA by terminally hybridized oligonucleotides
• Protection of RNA by 3′-terminal modifications
• Comparison with PNPase of E. coli
• Discussion
• Experimental procedures
• Cloning and expression of the pnp gene of T. thermophilus
• Isolation of Tth PNPase
• Enzyme assay
• Isolation of E. coli PNPase
• Homogenization
• Phase partitioning
• DEAE cellulose
• Autolysis
• Sepharose CL-6B
• Mono Q
• Superose 6
• RNA sequences
• RNA preparations
• RNA:oligonucleotide hybridization
• RNA degradation and analysis
• Preparation of oligodeoxyribonucleotides with uniform 5′ ends
• Reverse transcription
• PCR
• Acknowledgements
• References
• Supplementary material