Báo cáo khoa học: Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular characterization of the cel7 gene from the filamentous fungus, Talaromyces emersonii

Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular characterization of the cel7 gene from the filamentous fungus, Talaromyces emersonii

Tác giả: Alice Grassick, Patrick G. Murray, Roisin Thompson, Catherine M. Collins, Lucy Byrnes, Gabriel Birrane, Timothy M. Higgins, and Maria G. Tuohy

Lĩnh vực: Sinh hóa học, Công nghệ sinh học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này trình bày cấu trúc không gian ba chiều của cellobiohydrolase IB (CBH IB) dạng native từ nấm sợi Talaromyces emersonii, đạt độ phân giải 2.4 Å. CBH IB là một glycoprotein có cấu trúc dạng β-sandwich lớn, đặc trưng cho nhóm enzyme glycosyl hydrolase họ 7 (GH7). Nghiên cứu cũng mô tả việc phân lập gen cel7 mã hóa cho CBH IB, biểu hiện tái tổ hợp trong Escherichia coli, phân tích điều hòa phiên mã và cấu trúc của vùng thượng nguồn gen. Cấu trúc 3D của CBH IB cho thấy sự bảo tồn của đường hầm liên kết cellulose và các gốc xúc tác so với các enzyme tương tự, nhưng có sự khác biệt về tính chất liên kết và xúc tác do các thay đổi ở vùng vòng lặp. Gen cel7 được biểu hiện ở mức độ cao khi sử dụng cellulose, xylose hoặc lactose làm nguồn carbon, và bị ức chế mạnh bởi glucose. Các phân tích về vùng thượng nguồn gen cel7 đã xác định các yếu tố điều hòa tiềm năng, bao gồm các vị trí liên kết cho các yếu tố phiên mã cellulase và yếu tố ức chế catabolit.

Mục lục chi tiết:

• Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular characterization of the cel7 gene from the filamentous fungus, Talaromyces emersonii
• PCR cloning of genomic DNA
• Rapid amplification of cDNA ends
• Isolation of cel7 cDNA and genomic genes
• Sequence analysis
• Expression of cel7 in E. coli
• Denaturation and refolding of reCBH and enzyme assay
• Purification of CBH IB
• Crystallization and data collection
• Structure solution
• Structure refinement
• Results
• Isolation of genomic and cDNA clones
• Sequence analysis
• Analysis of the T. emersonii cel7 upstream region
• Northern blot analysis of T. emersonii cel7 expression
• Expression of cel7 in E. coli
• Structure solution and refinement of CBH IB
• Structure of T. emersonii 1Q9H, in comparison with P. chrysosporium 1GPI and T. reesei 1CEL
• Substrate-binding subsites
• Tunnel-forming loops
• Catalytic binding site
• Discussion
• Acknowledgements
• References