Báo cáo khoa học: Structural studies of thymidine kinases from Bacillus anthracis and Bacillus cereus provide insights into quaternary structure and conformational changes upon substrate binding

Structural Studies Of Thymidine Kinases From Bacillus Anthracis And Bacillus Cereus Provide Insights Into Quaternary Structure And Conformational Changes Upon Substrate Binding

Tên đề tài: Structural studies of thymidine kinases from Bacillus anthracis and Bacillus cereus provide insights into quaternary structure and conformational changes upon substrate binding

Tác giả: Urszula Kosinska, Cecilia Carnrot, Michael P. B. Sandrini, Anders R. Clausen, Liya Wang, Jure Piskur, Staffan Eriksson and Hans Eklund

Lĩnh vực: Sinh học phân tử, Hóa sinh

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này mô tả cấu trúc 3D của hai enzyme thymidine kinase (TK) từ hai loài vi khuẩn Bacillus anthracis (Ba-TK) và Bacillus cereus (Bc-TK). Các enzyme này có sự tương đồng trình tự amino acid cao (96%), cho phép xem xét chúng như là cùng một enzyme ở các giai đoạn phản ứng khác nhau. Nghiên cứu tập trung vào việc so sánh cấu trúc của Ba-TK với chất nền dT và Bc-TK với chất ức chế phản hồi dTTP. Các kết quả cho thấy sự khác biệt trong cấu trúc bậc bốn và sự thay đổi cấu trúc khi enzyme liên kết với chất nền hoặc chất ức chế. Cụ thể, cấu trúc của Ba-TK với dT cho thấy một dạng tetramer chặt chẽ hơn so với Bc-TK với dTTP, nơi enzyme thể hiện dạng tetramer lỏng lẻo hơn. Một điểm khác biệt quan trọng là sự hiện diện của “vùng lasso” (lasso-domain) ở trạng thái đóng trong Ba-TK khi có chất nền, và ở trạng thái mở trong Bc-TK khi không có chất nền. Nghiên cứu cũng làm sáng tỏ vai trò của “vùng beta-hairpin gắn phosphate” (phosphate-binding β-hairpin) trong việc ổn định cấu trúc và tương tác với chất cho phosphate. Các phân tích bổ sung về cấu trúc bậc bốn bằng phương pháp lọc gel và tán xạ ánh sáng động đã chỉ ra rằng các enzyme TK này có thể tồn tại ở cả dạng dimer và tetramer trong dung dịch, tùy thuộc vào điều kiện.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Keywords
• Correspondence
• Results
• Overall structure
• Ba-TK
• Bc-TK
• Figure 1. Superposition of subunits of Ba-TK with dT (in green) and Bc-TK with phosphate donor-mimicking dTTP and MPD bound in the thymine-binding pocket (in yellow). The lasso-loop is in closed conformation when dT is present and in open conformation when the substrate is absent. The phosphate donor stabilizes the P-β-hairpin. This part of the molecule is flexible and could not be traced in Ba-TK.
• Figure 2. (A) The active site of Ba-TK is occupied by dT and a phosphate ion. The active site is lined by hydrophobic residues. The map is a Fo-Fc map contoured at 3σ (0.1 e/ų). (B) The phosphate donor site of Bc-TK with dTTP mimicking the phosphate donor. The base of the phosphate donor is stacked between Phe18 and Phe34 each from adjacent subunits shown in yellow and orange, respectively. The phosphates are ligated by side-chain and main-chain atoms from the P-loop and P-β-hairpin. The map is a Fo-Fc map contoured at 3σ (0.1 e/ų).
• Figure 3. Amino-acid sequence alignment of the TK1-like enzymes from B. anthracis (AAT57468), B. cereus (DQ384595), C. acetobutylicum (NP_349490.1), U. urealyticum (NP_078433), human (P04183), mouse (NP_033413), Arabidosis thaliana (AAM63086.1), Escherichia coli (NP_415754.1) and Yersinia pestis (NP_405720.1). The secondary-structure elements for Ba-TK and Bc-TK are shown above the alignment. The P-loop and the zinc coordinating motifs are boxed. The catalytic Glu89 is marked in red, and the Phe18 and Phe34, which stack the base of the phosphate donor, are marked in green. Whereas the catalytic base is conserved among TKs from different kingdoms, the stacking phenylalanines are exchanged for hydrophilic residues in Gram-negative bacteria. The residues marked in blue take part in subunit-subunit interactions.
• Figure 4. (A) The subunit-subunit interactions along α1 as observed in Ba-TK (green) and Bc-TK (yellow). The distance between neighboring subunits is ≈3 Å wider in Bc-TK than in Ba-TK. (B) The β-sheet subunit-subunit interactions. In this interaction area, the distance between adjacent subunits is the same for Ba-TK (green) and Bc-TK (yellow). (C) The helical interactions as observed in Bc-TK (yellow) and Ca-TK (grey). Both structures are of the enzymes with occupied phosphate-donor sites, but without substrates. The distance between the adjacent helices is the same in both structures, and the lasso-loops are in open conformation. (D) The superposition of Ba-TK (green), Uu-TK (grey) and hTK1 (black) shows that the helices in adjacent subunits are closer together when the phosphate-donor is absent. In all three enzymes, the lasso-loop is closed down over the active site.
• Figure 5. Size distribution by volume of (A) Ba-TK at a concentration of 3 mg·mL⁻¹ (red), 1 mg·mL⁻¹ (green) and 1 mg·mL⁻¹ +2 mM ATP (blue). The molecular masses calculated from the hydrodynamic radius (4.3 nm for Ba-TK at 3 mg·mL⁻¹ and 3.2 nm for Ba-TK at 1 mg·mL⁻¹ +2 mM ATP) are 104 kDa (tetramer) and 51 kDa (dimer), respectively. (B) Bc-TK at a concentration of 3 mg·mL⁻¹ (red), 1 mg·mL⁻¹ (green) and 1 mg·mL⁻¹ +2 mM ATP (blue). The molecular mass calculated from the hydrodynamic radius (3.1-3.3 nm for all Bc-TK samples) is 46 kDa, corresponding to a dimer.
• Subunit-subunit interactions
• Quaternary structure
• Discussion
• Experimental procedures
• Protein expression and purification
• Crystallization, data collection and structure determination
• Determination of quaternary structure with dynamic light scattering
• Acknowledgements
• References
• Supplementary material