LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis

LmbE Proteins From Bacillus Cereus

Tên đề tài: LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis

Tác giả: Alexandra Deli, Dimitrios Koutsioulis, Vasiliki E. Fadouloglou, Panagiota Spiliotopoulou, Stavroula Balomenou, Sofia Arnaouteli, Maria Tzanodaskalaki, Konstantinos Mavromatis, Michalis Kokkinidis, Vassilis Bouriotis

Lĩnh vực: Enzyme Biotechnology, Biology

Nội dung tài liệu:

Nghiên cứu này tập trung vào việc làm sáng tỏ vai trò của hai enzyme de-N-acetylase từ loài Bacillus cereus, là các đồng phân của protein LmbE. Với sự tương đồng cao giữa B. cereus và B. anthracis, kết quả nghiên cứu này có thể đóng góp vào việc hiểu sâu hơn về sinh lý học của các vi sinh vật gây bệnh thú vị này. Hai enzyme de-N-acetylase tái tổ hợp từ B. cereus ATCC14579 đã được đặc trưng về mặt sinh hóa. Các enzyme này thể hiện khối lượng phân tử, pH và nhiệt độ tối ưu khác nhau, cùng với đặc tính nền của cơ chất rộng, có khả năng de-N-acetyl hóa GlcNAc và các oligomer N-acetylchito (GlcNAc2, GlcNAc3 và GlcNAc4), cũng như GlcNAc-1P, GlcNAc-6P, GalNAc, ManNAc và UDP-GlcNAc. Phân tích động học về hoạt tính của BC1534 và BC3461 đối với GlcNAc và GlcNAc2 cho thấy GlcNAc2 là cơ chất ưu tiên cho cả hai enzyme tự nhiên. Dựa trên cấu trúc tinh thể gần đây của BC1534, phân tích đột biến đã xác định các gốc chức năng quan trọng, nhấn mạnh tầm quan trọng của chúng đối với cơ chế xúc tác và đặc tính cơ chất của enzyme. Hiệu quả xúc tác của các biến thể BC1534 đã giảm đáng kể so với enzyme tự nhiên. Cây dựa trên sự sắp xếp cho thấy cả hai de-N-acetylase đều thuộc các loại chức năng khác biệt với các protein LmbE khác.

Mục lục chi tiết:

• Keywords
• Correspondence
• *Present address
• Abbreviations
• Introduction
• Results
• Identification of bc1534 and bc3461 from B. cereus ATCC14579 and comparison with B. anthracis homologs
• Cloning, expression and purification of BC1534
• Cloning, expression and purification of BC3461
• Enzymatic properties of BC1534 and BC3461
• Table 1. Substrate specificity (percentage relative activity) of BC3461, BC1534 and mutants.
• Table 2. Kinetic parameters of BC3461 and BC1534 (wild-type and variants) towards GlcNAc and GlcNAc2.
• Mutational analysis of BC1534
• Prediction of function
• Discussion
• Experimental procedures
• Materials
• Construction of expression plasmids
• Production and purification of BC4361, BC1534 and BC1534 variants
• Preparation of radiolabeled substrates
• Enzyme assays
• Fluorescamine-based de-N-acetylase activity assay
• RT-PCR
• Construction of BC1534 variants
• Autodocking
• Alignment-based tree
• Acknowledgements
• References