A Novel Prokaryotic L-arginine:glycine Amidinotransferase Is Involved in Cylindrospermopsin Biosynthesis

A Novel Prokaryotic L-arginine:glycine Amidinotransferase Is Involved in Cylindrospermopsin Biosynthesis

Tác giả: Julia Muenchhoff, Khawar S. Siddiqui, Anne Poljak, Mark J. Raftery, Kevin D. Barrow, Brett A. Neilan

Lĩnh vực: Biotechnology, Biomolecular Sciences, Mass Spectrometry, Medical Sciences

Nội dung tài liệu:

Nghiên cứu này báo cáo về việc mô tả lần đầu tiên một L-arginine:glycine amidinotransferase (CyrA) có nguồn gốc từ sinh vật nhân sơ. Enzyme này đóng vai trò trong con đường sinh tổng hợp cylindrospermopsin, một loại độc tố gan do vi khuẩn lam Cylindrospermopsis raciborskii AWT205 sản xuất. CyrA có sự khác biệt về mặt phát sinh loài so với các amidinotransferase khác. Phân tích cấu trúc cho thấy sự khác biệt giữa các dư lượng tại vị trí hoạt động của CyrA và L-arginine:glycine amidinotransferase ở người. Enzyme đã được biểu hiện và xác định chức năng trong vi khuẩn Escherichia coli. Kết quả ‘H NMR đã xác nhận chức năng L-arginine:glycine amidinotransferase của CyrA. So với enzyme của con người (AGAT), CyrA thể hiện ái lực chất nền hẹp và động học Michaelis-Menten không tuân theo quy luật thông thường khi có mặt hydroxylamine. Các nghiên cứu về vận tốc phản ứng ban đầu, ức chế sản phẩm và xác định sản phẩm trung gian đã được sử dụng để làm sáng tỏ cơ chế động học phức tạp của CyrA, một sự kết hợp giữa cơ chế ping-pong và tuần tự. Các khác biệt tại vị trí hoạt động của CyrA và AGAT được thảo luận liên quan đến các đặc tính khác biệt của hai enzyme này. CyrA có hoạt tính cực đại ở pH 8.5 và độ ổn định cực đại ở pH 6.5, với nhiệt độ tối ưu là 32 °C. Nghiên cứu về độ ổn định cho thấy một dạng bất hoạt của enzyme này vẫn giữ được cấu trúc bậc hai đáng kể ngay cả khi gia nhiệt lên 94 °C, nhưng mất cấu trúc bậc ba ở nhiệt độ thấp, tạo thành trạng thái giống “molten globule”. CyrA đại diện cho một nhóm amidinotransferase mới từ sinh vật nhân sơ sử dụng arginine và glycine làm chất nền, với cơ chế động học phức tạp và ái lực chất nền khác biệt so với các amidinotransferase ở sinh vật nhân chuẩn.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Keywords
• Correspondence
• Results
• Physicochemical properties of CyrA
• Analysis of end-products confirmed CyrA as an L-arginine:glycine amidinotransferase
• CyrA has narrow substrate specificity
• Kinetic analyses with natural substrates suggest a reaction mechanism different from that of other amidinotransferases
• Kinetic analyses with a non-natural acceptor reveal a complex kinetic mechanism
• Product inhibition also suggests a random sequential mechanism
• Analysis of reaction products with only the amidino group donor
• CyrA is a thermolabile molten globule
• CyrA has optimum stability around neutral pH, in contrast to its alkaline pH activity optimum
• Discussion
• Experimental procedures
• Acknowledgements
• References
• Supporting information