Báo cáo Y học: Inhibition of SERCA Ca2+ pumps by 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) 2-APB reduces both Ca2+ binding and phosphoryl transfer from ATP, by interfering with the pathway leading to the Ca2+-binding sites

Inhibition of SERCA Ca²+ pumps by 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB)

Tác giả: Jonathan G. Bilmen, Laura L. Wootton, Rita E. Godfrey, Oliver S. Smart and Francesco Michelangeli

Lĩnh vực: Sinh học phân tử, Hóa sinh

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc khám phá cơ chế hoạt động của 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) như một chất ức chế đối với các bơm Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase (SERCA). Các thí nghiệm được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của 2-APB lên hoạt động của enzyme, bao gồm khả năng gắn kết Ca2+ và quá trình phosphoryl hóa ATP. Kết quả cho thấy 2-APB làm giảm ái lực gắn kết Ca2+ và ức chế phosphoryl hóa ATP, mà không ảnh hưởng đến quá trình gắn kết nucleotide. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng 2-APB có thể tăng cường sự rò rỉ ion qua màng phospholipid, và hiệu quả ức chế SERCA của nó phụ thuộc vào các isoform và pH.

Mục lục chi tiết:

• Inhibition of SERCA Ca²+ pumps by 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB)
• 2-APB reduces both Ca²+ binding and phosphoryl transfer from ATP, by interfering with the pathway leading to the Ca²+-binding sites
• Materials and Methods
• Expression of the Ca²+-ATPase in COS-7 cells
• Membrane and protein purification
• Ca²+-ATPase activity
• Effects of 2-APB on FITC-labelled Ca²+-ATPase
• Phosphorylation studies
• TNP-ADP binding to Ca²+-ATPase
• Membrane permeability studies
• Tryptophan fluorescence to follow Ca²+-induced conformational changes
• Measurement of the transient kinetics of the conformational changes associated with Ca²+-binding and dissociation
• Measurement of 45Ca²+-binding to the ATPase
• Modeling of the 2-APB-binding site on the Ca²+-ATPase
• Results
• Inhibition of Ca²+-ATPase activity and Ca²+ uptake
• 2-APB affects membrane leakage
• Inhibition of purified Ca²+ ATPase
• The effects of tryptophan fluorescence changes associated with Ca²+ binding
• Measuring 45Ca²+ binding to the ATPase
• Kinetics of conformational changes associated with Ca²+ binding and dissociation to the Ca²+-ATPase
• E2 → E1 transition of the ATPase
• ATP binding and phosphorylation of the Ca²+-ATPase
• Effects of 2-APB on mutant Ca²+-ATPase activity
• Discussion
• Acknowledgements
• References