Báo cáo Y học: Role of tyrosine 238 in the active site of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase A site-directed mutagenesis study

Role of tyrosine 238 in the active site of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase

Tác giả: Angelo Boselli, Silvia Sacchi, Viviana Job, Mirella S. Pilone and Loredano Pollegioni

Lĩnh vực: Department of Structural and Functional Biology, University of Insubria, Varese, Italy

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào vai trò của Tyrosine 238 (Y238) trong vị trí hoạt động của enzyme D-amino acid oxidase (DAAO) từ nấm men Rhodotorula gracilis. Thông qua phương pháp đột biến định hướng tại chỗ (site-directed mutagenesis), các nhà nghiên cứu đã thay thế Y238 bằng Phenylalanine (Y238F) và Serine (Y238S) để đánh giá ảnh hưởng của sự thay đổi này đến chức năng và cấu trúc của enzyme. Các kết quả cho thấy Y238 không đóng vai trò là một acid/base catalyst trong vị trí hoạt động, mà thay vào đó, nó ảnh hưởng đến khả năng tiếp cận của cơ chất và sự giải phóng sản phẩm khỏi vị trí hoạt động. Các thí nghiệm về động học enzyme, phổ học và tương tác với các chất ức chế cạnh tranh đã được thực hiện để làm rõ vai trò của Y238.

Mục lục chi tiết:

• Role of tyrosine 238 in the active site of Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase: A site-directed mutagenesis study
• Introduction
• Materials and Methods
• Reagents
• Site-directed mutagenesis and enzyme expression
• Activity assay and gel electrophoresis
• Spectral and ligand binding experiments
• Redox potentials
• Stopped-flow measurements
• Results
• Enzyme expression and purification
• Spectral properties and redox potentials
• Ligand binding
• Steady-state and rapid reaction kinetics with D-alanine
• Substrate specificity
• Discussion
• Acknowledgements
• References