Xem trước tài liệu

Đang tải tài liệu...

Thông tin chi tiết tài liệu

Định dạng: PDF
Số trang: 11 trang
Dung lượng: 234 KB

Giới thiệu nội dung

Oxidation of Propionate to Pyruvate in Escherichia coli

Tên đề tài: Oxidation of propionate to pyruvate in Escherichia coli

Tác giả: Matthias Brock, Claudia Maerker, Alexandra Schütz, Uwe Völker, Wolfgang Buckel

Lĩnh vực: Vi sinh vật học, Hóa sinh

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này khám phá con đường oxy hóa propionate thành pyruvate ở vi khuẩn Escherichia coli. Công trình chỉ ra sự tham gia của hai enzyme chính là methylcitrate synthase và 2-methylisocitrate lyase, đồng thời xác định vai trò của một enzyme mới, methylcitrate dehydratase (PrpD), và enzyme quen thuộc aconitase (AcnB) trong quá trình đồng phân hóa (2S,3S)-methylcitrate thành (2R,3S)-2-methylisocitrate. Nghiên cứu cũng mô tả chi tiết các phương pháp thực nghiệm, bao gồm việc tinh sạch enzyme, phân tích hoạt tính, điện di protein và phân tích biểu hiện gen thông qua Northern blot, nhằm làm sáng tỏ cơ chế phân tử của quá trình chuyển hóa này.

Mục lục chi tiết:

  • Introduction
  • Experimental Procedures
  • Bacteria and culture conditions
  • Purification of 2-methylisocitrate dehydratase (AcnB) from E. coli W3350
  • Overproduction and purification of PrpB and PrpD with N-terminal histidine tags
  • Enzymatic synthesis of (2S,3S)-methylcitrate
  • Enzyme assays
  • Gel electrophoresis and blotting of proteins
  • Re-activation and inactivation of AcnB
  • Iron-sulfur cluster and metal cofactors
  • Synthesis of digoxygenin-labelled RNA probes
  • 2D gel electrophoresis
  • Protein identification by peptide mass fingerprinting
  • RNA isolation and Northern blot
  • RESULTS
  • Biochemical analysis of 2-methylisocitrate dehydratase
  • Pathway of propionate oxidation to pyruvate
  • Purification protocol for AcnB
  • Analysis of the purification of AcnB by SDS/PAGE
  • Analysis of purified PrpD by SDS/PAGE
  • Substrate specificity of PrpD
  • UV spectra and difference spectrum of 2-methyl-cis-aconitate and 2-methyl-cis-aconitate anhydride
  • In vitro reconstitution of the methylcitrate cycle
  • Northern-blot analysis of prpD, prpE, acnB and acs transcripts
  • Comparison of the protein profile of E. coli grown in minimal medium with acetate (A) or propionate (B) as carbon sources
  • DISCUSSION
  • ACKNOWLEDGEMENTS
  • REFERENCES