Báo cáo khoa học: Structure determination and biochemical studies on Bacillus stearothermophilus E53Q serine hydroxymethyltransferase and its complexes provide insights on function and enzyme memory

Structure Determination and Biochemical Studies on Bacillus Stearothermophilus E53Q Serine Hydroxymethyltransferase and Its Complexes Provide Insights on Function and Enzyme Memory

Tác giả: V. Rajaram, B. S. Bhavani, Purnima Kaul, V. Prakash, N. Appaji Rao, H. S. Savithri, and M. R. N. Murthy

Lĩnh vực: Hóa sinh, Cấu trúc phân tử

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này trình bày kết quả xác định cấu trúc tinh thể và các nghiên cứu sinh hóa đối với enzyme serine hydroxymethyltransferase (SHMT) đột biến E53Q từ vi khuẩn Bacillus stearothermophilus (bsSHMT) và các phức hợp của nó. SHMT là enzyme phụ thuộc pyridoxal 5′-phosphate (PLP) xúc tác cho phản ứng chuyển hóa L-Serine và tetrahydrofolate (THF) thành Glycine và 5,10-methylene tetrahydrofolate. Nghiên cứu này tập trung làm rõ vai trò của gốc glutamate ở vị trí 53 (E53) trong hoạt động xúc tác và khả năng “ghi nhớ enzyme” của SHMT. Bằng cách thay thế E53 bằng glutamine (Q53), các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy những thay đổi đáng kể về mặt cấu trúc và chức năng, bao gồm cả sự mất hoàn toàn hoạt tính phụ thuộc THF và sự thay đổi trong ái lực liên kết với THF/5-formyl THF. Đặc biệt, cấu trúc của phức hợp E53QbsSHMT với Glycine và 5-formyl THF đã cho thấy một dạng gem-diamine của PLP bị khóa lại, ngay cả khi 5-formyl THF không còn liên kết. Điều này cung cấp bằng chứng trực tiếp về hiện tượng “ghi nhớ enzyme” dựa trên cấu trúc, lần đầu tiên được quan sát trong các nghiên cứu cấu trúc. Các kết quả này nhấn mạnh vai trò quan trọng của E53 trong việc định vị chất nền và cofactor, cũng như trong việc cho phép cơ chế tấn công trực tiếp của THF vào L-Serine.

Mục lục chi tiết:

• Structure determination and biochemical studies on Bacillus stearothermophilus E53Q serine hydroxymethyltransferase and its complexes provide insights on function and enzyme memory
• Keywords
• Correspondence
• Abbreviations
• Serine hydroxymethyltransferase (SHMT)
• Results and Discussion
• E53QbsSHMT internal aldimine
• E53QbsSHMT-Gly external aldimine
• E53QbsSHMT in presence of Gly and FTHF
• E53QbsSHMT-Ser external aldimine
• E53QbsSHMT and bsSHMT in presence of L-allo-threonine
• Conclusions
• Experimental procedures
• Materials
• Bacterial strains and growth conditions
• DNA manipulations
• Expression and purification of bsSHMT and E53QbsSHMT
• Crystallization, data collection and processing
• Structure solution and model building
• Enzyme assays
• Spectroscopic experiments
• Absorption spectra
• Steady state kinetic studies
• CD spectra
• Stopped-flow spectrophotometry
• Estimation of PLP at the active site
• Thermal denaturation studies
• Acknowledgements
• References