Luận án Tiến sĩ Sinh học: Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn dạ cỏ dê và khai thác, nghiên cứu tính chất của endo-xylanase

Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn dạ cỏ dê và khai thác, nghiên cứu tính chất của endo-xylanase

Tác giả: Đào Trọng Khoa

Lĩnh vực: Sinh học

Nội dung tài liệu:

Luận án tiến sĩ này tập trung vào việc xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê. Nghiên cứu nhằm mục đích khai thác hiệu quả các gene chức năng, đặc biệt là các gene mã hóa enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa lignocellulose, và tiến hành nghiên cứu sâu về tính chất của một loại enzyme endo-xylanase. Phương pháp Metagenomics được áp dụng để giải mã toàn bộ hệ gene của quần xã vi sinh vật trong dạ cỏ dê, khắc phục hạn chế của các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Luận án cũng đề cập đến việc thiết lập công cụ HMM để hỗ trợ chú giải gene và khai thác các enzyme tiềm năng. Cuối cùng, nghiên cứu đã biểu hiện thành công enzyme endo-xylanase và xác định các đặc tính của nó, mở ra hướng ứng dụng trong sản xuất ethanol và các lĩnh vực khác.

Mục lục chi tiết:

• Lời cam đoan
• Lời cảm ơn
• Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
• Danh mục bảng
• Danh mục hình
• Mở đầu
• Chương 1. Tổng quan
• 1.1. Kỹ thuật Metagenomics nhằm khai thác hiệu quả gene tiềm năng
• 1.1.1. Sơ lược chung về kỹ thuật Metagenomics
• 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong khai thác gene
• 1.1.2.1. Nghiên cứu ứng dụng Metagenomics trên thế giới
• 1.1.2.2. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Metagenomics ở Việt Nam
• 1.1.3. Chú giải gene trong tin sinh học
• 1.1.3.1. Một số công cụ chú giải gene thông dụng
• 1.1.3.2. Mô hình đại diện HMM: công cụ mới khai thác hiệu quả dữ liệu metagenome
• 1.2. Tổng quan về lignocellulose
• 1.2.1. Vai trò của lignocellulose trong nền kinh tế sinh học
• 1.2.1.1. Lignocellulose là nguồn năng lượng tái tạo phong phú
• 1.2.1.2. Lignocellulose là nguồn tiềm năng sản xuất vật liệu, hóa chất mới
• 1.2.2. Enzyme phân giải lignocellulose nói chung
• 1.2.2.1. Enzyme thủy phân pectin, lignin và các enzyme hỗ trợ khác
• 1.2.2.2. Cellulase và hemicellulase
• 1.2.2.3. Vi khuẩn tham gia chuyển hóa lignocellulose trong dạ cỏ
• 1.2.3. Xylanase
• 1.2.3.1. Vai trò của xylanase
• 1.2.3.2. Phân loại xylanase
• 1.2.3.3. Xylanase trong tự nhiên
• 1.2.3.4. Ứng dụng của xylanase
• 1.2.3.5. Tình hình biểu hiện xylanase trong nước và trên thế giới
• Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
• 2.1. Đối tượng, vật liệu hóa chất và thiết bị máy móc
• 2.1.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 2.1.2. Một số dung dịch hóa chất chính
• 2.1.3. Máy móc và thiết bị
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử, vi sinh vật
• 2.2.1.1. Tách chiết, tinh chế DNA metagenome
• 2.2.1.2. Phương pháp giải trình tự đa hệ gene
• 2.2.1.3. Tổng hợp gene, thiết kế vector biểu hiện mang gene exl
• 2.2.1.4. Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E. coli
• 2.2.1.5. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli
• 2.2.1.6. Điện di trên gel agarose
• 2.2.1.7. Tinh chế DNA từ gel agarose
• 2.2.2. Các phương pháp hóa sinh protein
• 2.2.2.1. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli
• 2.2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide
• 2.2.2.3. Tách chiết protein tái tổ hợp và tinh chế bằng sắc kí ái lực His-tag
• 2.2.2.4. Xác định độ sạch của enzyme tái tổ hợp bằng phần mềm Quantity One
• 2.2.2.5. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 2.2.2.6. Xác định hoạt tính enzyme
• 2.2.2.7. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, các ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt tính enzyme
• 2.2.2.8. Xác định độ bền nhiệt của enzyme
• 2.2.2.9. Xác định thông số động học của enzyme
• 2.2.3. Các phương pháp tin sinh học
• 2.2.3.1. Lắp ráp DNA đa hệ gene, chú giải các gene chức năng
• 2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu Pfam của các trình tự
• 2.2.3.3. Nghiên cứu vùng bảo thủ và dự đoán cấu trúc bậc ba của các trình tự
• 2.2.3.4. Dự đoán khả năng chịu kiềm/acid
• 2.2.3.5. Dự đoán khả năng chịu nhiệt của enzyme
• 2.2.3.6. Định loại loài các trình tự ORF
• 2.2.3.7. Tối ưu mã và tổng hợp gene mã hóa enzyme thủy phân xylan được khai thác từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê
• 2.2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
• Chương 3. Kết quả và thảo luận
• 3.1. Nghiên cứu giải mã xây dựng bộ dữ liệu và đánh giá đa dạng vi khuẩn trong dạ cỏ dê
• 3.1.1. Tách chiết DNA đa hệ gene của vi khuẩn
• 3.1.2. Giải trình tự, đánh giá chất lượng bộ dữ liệu và chú giải gene
• 3.1.3. Đánh giá đa dạng vi khuẩn trong mẫu DNA metagenome
• 3.1.3.1. Đa dạng vi khuẩn trong dạ cỏ dê được đánh giá dựa trên bộ dữ liệu 8,6 Gb
• 3.1.3.2. Đa dạng vi khuẩn trong dạ cỏ dê được đánh giá dựa trên bộ dữ liệu giải mã sâu
• 3.2. Khai thác gene và thiết lập công cụ HMM cho chú giải gene, khai thác gene mã hóa protein/enzyme tham gia thủy phân lignocellulose trong dạ cỏ dê
• 3.2.1. Khai thác gene mã hóa enzyme thủy phân ligncoellulose dựa trên cơ sở dữ liệu KEGG
• 3.2.1.1. Khai thác gene từ dữ liệu giải trình tự 8,6 Gb
• 3.2.1.2. Khai thác gene từ dữ liệu giải trình tự sâu 48,6 Gb
• 3.2.2. Phân tích đa dạng vi khuẩn mang gene thủy phân lignocellulose
• 3.2.2.1. Đa dạng vi khuẩn mang gene phân giải lignocellulose khai thác được từ dữ liệu 8,6 Gb
• 3.2.2.2. Đa dạng vi khuẩn mang gene phân giải lignocellulose khai thác từ kết quả giải trình tự sâu
• 3.2.2.3. Vai trò của chi Prevotella trong phân giải lignocellulose
• 3.2.2.4. Vai trò của chi Prevotella trong hỗ trợ tiêu hóa các nguồn thức ăn khác trong dạ cỏ dê
• 3.2.3. Xây dựng công cụ mới khai thác hiệu quả protein/enzyme tham gia chuyển hóa và tiền xử lý lignocelullose
• 3.2.3.1. Xây dựng mô hình HMM đại diện cho các enzyme/protein cần khai thác
• 3.2.3.2. Khai thác các enzyme tham gia thủy phân lignocellulose từ dữ liệu DNA đa hệ gene vi khuẩn trong dạ cỏ dê
• 3.3. Nghiên cứu lựa chọn, biểu hiện và xác định đặc điểm của endo-xylanase
• 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn gene mã hóa endo-xylanase cho biểu hiện
• 3.3.1.1. Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn mang enzyme endo-xylanase
• 3.3.1.2. Nghiên cứu đa dạng cấu trúc endo-xylanase
• 3.3.1.3. Nghiên cứu lựa chọn trình tự xylanase để biểu hiện
• 3.3.2. Nghiên cứu biểu hiện endo-xylanase
• 3.3.2.1. Phân tích tối ưu mã bộ ba của trình tự gene exl
• 3.3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện mang gene exl
• 3.3.2.3. Biểu hiện gene endo-xylanase [denovogenes]_5086
• 3.3.3. Tinh chế protein endo-xylanase tái tổ hợp
• 3.3.3.1. Tinh chế endo-xylanase bằng sắc ký ái lực His-tag
• 3.3.3.2. Loại muối protein endo-xylanase sau khi tinh sạch
• 3.3.4. Nghiên cứu đặc tính enzyme xylanase và các thông số động học enzyme
• 3.3.4.1. Nghiên cứu xác định nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động
• 3.3.4.2. Nghiên cứu xác định pH tối ưu cho enzyme hoạt động
• 3.3.4.3. Nghiên cứu tính bền nhiệt của enzyme
• 3.3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số ion kim loại và hóa chất lên hoạt tính xylanase
• 3.3.4.5. Nghiên cứu tính đặc hiệu cơ chất của enzyme
• 3.3.4.6. Nghiên cứu thông số động học của enzyme endo xylanase tái tổ hợp
• Kết luận và kiến nghị
• Kết luận
• Danh mục tài liệu tham khảo