Báo cáo Y học: The role of the second binding loop of the cysteine protease inhibitor, cystatin A (stefin A), in stabilizing complexes with target proteases is exerted predominantly by Leu73

The Role of the Second Binding Loop of the Cysteine Protease Inhibitor, Cystatin A (Stefin A), in Stabilizing Complexes with Target Proteases is Exerted Predominantly by Leu73

Tác giả: Alona Pavlova, Sergio Estrada, Ingemar Björk

Lĩnh vực: Department of Veterinary Medical Chemistry, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala Biomedical Centre, Sweden

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này nhằm làm sáng tỏ vai trò của các gốc amino acid riêng lẻ trong vòng liên kết thứ hai linh hoạt của cystatin A người trong việc ức chế các protease cysteine. Bốn biến thể tái tổ hợp của chất ức chế, mỗi biến thể có một đột biến duy nhất, L73G, P74G, Q76G hoặc N77G, trong phần lộ ra nhiều nhất của vòng này đã được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến định hướng theo PCR. Sự liên kết của các biến thể này với papain, cathepsin L và cathepsin B đã được đặc trưng bằng các phương pháp cân bằng và động học. Đột biến Leu73 làm giảm ái lực đối với papain, cathepsin L và cathepsin B tương ứng khoảng 300 lần, hơn 10 lần và khoảng 4000 lần. Đột biến Pro74 làm giảm ái lực đối với cathepsin B khoảng 10 lần nhưng ảnh hưởng tối thiểu đến ái lực đối với hai enzyme còn lại. Đột biến Gln76 và Asn77 không làm thay đổi ái lực của cystatin A đối với bất kỳ protease nào được nghiên cứu. Sự giảm ái lực là do hằng số tốc độ phân ly tăng lên. Những kết quả này cho thấy vòng liên kết thứ hai của cystatin A đóng một vai trò quan trọng trong việc ổn định phức hợp với các protease bằng cách làm chậm quá trình phân ly của chúng. Trái ngược với cystatin B, chỉ có một gốc amino acid của vòng, Leu73, là quan trọng nhất đối với hiệu ứng này, Pro74 hỗ trợ ở mức độ nhỏ trong trường hợp liên kết với cathepsin B. Đóng góp của vòng liên kết thứ hai của cystatin A vào việc liên kết với protease thay đổi tùy thuộc vào protease, lớn nhất, khoảng 45% tổng năng lượng liên kết, đối với việc ức chế cathepsin B.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and Methods
• Construction of expression vectors for cystatin A second-loop mutants
• Chicken cystatin
• Proteases
• Determination of protein concentration
• Binding stoichiometries
• Inhibition constants
• Association kinetics
• Dissociation rate constants
• Fluorescence emission spectroscopy
• Protein modeling
• Miscellaneous procedures
• Experimental conditions
• RESULTS
• Preparation, homogeneity and activity of cystatin A mutants
• Binding affinity
• Association rate constants
• Dissociation rate constants
• Fluorescence emission difference spectra
• DISCUSSION
• ACKNOWLEDGEMENTS
• REFERENCES