Báo cáo khoa học: The changing patterns of covalent active site occupancy during catalysis on a modular polyketide synthase multienzyme revealed by ion-trap mass spectrometry

The Changing Patterns Of Covalent Active Site Occupancy During Catalysis On A Modular Polyketide Synthase Multienzyme Revealed By Ion-Trap Mass Spectrometry

Tác giả: Hui Hong, Peter F. Leadlay, James Staunton

Lĩnh vực: Hóa sinh, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật sắc ký khối phổ ion bẫy để phân tích mô hình chiếm dụng vị trí hoạt động cộng hóa trị của các chất nền và chất trung gian trong quá trình xúc tác trên một enzyme đa chức năng polyketide synthase. Các nhà nghiên cứu đã tập trung vào một enzyme đa chức năng diketide synthase (DKS) là mô-đun mở rộng đầu tiên của polyketide synthase erythromycin. Bằng cách sử dụng các chất nền tự nhiên và các chất nền thay thế, cùng với việc loại bỏ NADPH, nghiên cứu đã làm sáng tỏ các khía cạnh mới về cách thức các enzyme này hoạt động, bao gồm cả các bước giới hạn tốc độ và sự phối hợp giữa các vị trí hoạt động.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Abbreviations
• Results
• Discussion
• Identification of rate-limiting steps, and a model for suppression of iteration and the maintenance of fidelity of reduction
• Evidence for coordination of condensation and ketoreduction
• Experimental procedures
• Purification of the DEBS-derived DKS
• Limited proteolysis and LC/MS analysis
• Substrate specificity for the chain-extender unit
• Purification of commercial methylmalonyl-CoA
• Observation of intermediates on the DKS multienzyme
• Off-loading and analysis of the β-OH diketide from the diketide ACP-TE intermediate
• Acknowledgements
• References