Báo cáo khoa học: Studies on the regulatory properties of the pterin cofactor and dopamine bound at the active site of human phenylalanine hydroxylase

Studies on the regulatory properties of the pterin cofactor and dopamine bound at the active site of human phenylalanine hydroxylase

Tác giả: Therese Solstad, Anne J. Stokka, Ole A. Andersen, Torgeir Flatmark

Lĩnh vực: Biochemistry and Molecular Biology, Chemistry

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích các đặc tính điều hòa của enzyme hydroxylase phenylalanine (PAH) ở người, đặc biệt là vai trò của cofactor pterin và dopamine tại vị trí hoạt động. Enzyme PAH có vai trò xúc tác quá trình hydroxyl hóa L-phenylalanine thành tyrosine, một quá trình thiết yếu trong cơ thể. Hoạt động của enzyme này được điều chỉnh bởi ba cơ chế chính: kích hoạt bởi cơ chất (L-phenylalanine), ức chế bởi cofactor pterin, và phosphoryl hóa tại gốc serine (Ser16). Nghiên cứu sử dụng các phương pháp như phân tích protease giới hạn, chuyển đổi cấu trúc toàn cục có thể đảo ngược được kích hoạt bởi liên kết cơ chất, và tốc độ phosphoryl hóa Ser16 bởi kinase protein phụ thuộc cAMP. Các kết quả cho thấy cofactor pterin và dopamine, mặc dù liên kết ở các vị trí khác nhau, đều có ảnh hưởng điều hòa tiêu cực lên hoạt động của PAH. Tuy nhiên, sự liên kết của cơ chất L-Phe có khả năng đảo ngược hoàn toàn các tác động ức chế này. Nghiên cứu cũng so sánh các đặc tính ức chế của cofactor tự nhiên với cấu trúc tinh thể ba chiều sẵn có, cung cấp những hiểu biết quan trọng về cơ chế điều hòa.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and methods
• Expression and purification of recombinant hPAH
• Protein measurements
• Protein phosphorylation
• Limited proteolysis by trypsin
• Reversed-phase chromatography
• Surface plasmon resonance analyses
• Structural studies
• Results
• Effect of ligands on the limited proteolysis of recombinant wt-hPAH and its catalytic core
• Effect of Habiopterin/H2biopterin on the conformational transition (hysteresis) triggered by substrate binding as studied by surface plasmon resonance analysis
• Effect of active site ligands on the rate of phosphorylation of recombinant hPAH
• The molecular basis for the negative modulatory effects of the pterin cofactor and dopamine binding to wt-hPAH and their reversal by substrate
• Discussion
• On the pterin cofactor binding site
• The inhibited forms of the enzyme with bound biopterin cofactor or dopamine
• The interdependent binding of biopterin cofactor and amino acid substrate
• Acknowledgements
• References