Xem trước tài liệu

Đang tải tài liệu...

Thông tin chi tiết tài liệu

Định dạng: PDF
Số trang: 13 trang
Dung lượng: 197 KB

Giới thiệu nội dung

Small exterior hydrophobic cluster contributes to conformational stability and steroid binding in ketosteroid isomerase from Pseudomonas putida biotype B

Tác giả: Young S. Yun, Gyu H. Nam, Yeon-Gil Kim, Byung-Ha Oh, Kwan Y. Choi

Lĩnh vực: Hóa sinh, Cấu trúc protein

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này khám phá vai trò của một cụm kỵ nước nhỏ bên ngoài (SEHC) trong enzyme A5-3-ketosteroid isomerase (KSI-PI) từ Pseudomonas putida biotype B. SEHC, bao gồm các gốc Trp92, Leu125 và Val127, nằm ở bề mặt protein và tiếp xúc với dung môi. Thông qua các đột biến định hướng vị trí, nghiên cứu cho thấy SEHC đóng góp đáng kể vào sự ổn định cấu trúc và khả năng liên kết steroid của enzyme. Việc loại bỏ hoặc thay đổi các gốc kỵ nước trong SEHC dẫn đến giảm độ ổn định cấu trúc và ảnh hưởng đến ái lực liên kết với steroid. Cấu trúc tinh thể của dạng đột biến W92A cho thấy sự phá vỡ cấu trúc β-sheet tiếp xúc với dung môi, làm giảm độ ổn định của protein.

Mục lục chi tiết:

  • Introduction
  • Keywords
  • Correspondence
  • Database
  • Results
  • Structure of the SEHC
  • Mutational effect on catalysis
  • Effect of mutations on conformational stability
  • Unfolding kinetics
  • Analysis of the Φu value
  • Effect of mutations on d-equilenin binding
  • Effect of mutations on 17β-hydroxy-4-estren-3-one (19-nortestosterone) binding
  • Structural analysis of W92A
  • Discussion
  • Contribution of the SEHC to conformational stability
  • Contribution of the SEHC to recognition of steroids
  • Experimental procedures
  • Materials and reagents
  • Site-directed mutagenesis
  • Expression and purification of the KSI-PI proteins
  • Steady-state kinetic analysis
  • Calculation of accessible surface area
  • Equilibrium unfolding
  • Kinetic analysis of unfolding
  • Analysis of the Φu value
  • Determination of KD for d-equilenin
  • Determination of KD for 19-nortestosterone
  • Crystallization and structure determination of W92A
  • Acknowledgements
  • References