Recombinant expression of an insulin-like peptide 3 (INSL3) precursor and its enzymatic conversion to mature human INSL3

Recombinant Expression Of An Insulin-Like Peptide 3 (INSL3) Precursor And Its Enzymatic Conversion To Mature Human INSL3

Tác giả: Xiao Luo, Ross A. D. Bathgate, Ya-Li Liu, Xiao-Xia Shao, John D. Wade, Zhan-Yun Guo

Lĩnh vực: Peptide Hormone, Insulin Superfamily, Leydig Cells, Testes, RXFP2 Receptor, Recombinant Expression, E. coli

Nội dung tài liệu:
Nghiên cứu này trình bày phương pháp thiết kế và biểu hiện tái tổ hợp một tiền chất peptide giống insulin 3 (INSL3) dạng chuỗi đơn trong tế bào E. coli. Tiền chất này sau đó được hòa tan, tinh sạch gần như hoàn toàn và tái gấp nếp hiệu quả trong ống nghiệm. Tiếp theo, tiền chất tái gấp nếp được chuyển đổi thành INSL3 trưởng thành ở người bằng cách xử lý tuần tự với endoproteinase Lys-C và carboxypeptidase B. Phân tích phổ CD và lập bản đồ peptide xác nhận rằng INSL3 tái gấp nếp có cấu trúc giống insulin với các liên kết disulfide chính xác. INSL3 tái tổ hợp cho thấy hoạt tính đầy đủ, tương đương với INSL3 trưởng thành hai chuỗi, gợi ý rằng vùng liên kết thụ thể trong chuỗi B đã được duy trì trong cấu trúc hoạt động của tiền chất. Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp hiệu quả để chuẩn bị INSL3 trưởng thành và đồng thời tạo ra một khuôn mẫu chuỗi đơn hữu ích cho các nghiên cứu cấu trúc và chức năng sâu hơn của peptide này.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Results
• Gene construction, expression and purification of the single-chain INSL3 precursor
• In vitro refolding of the single-chain INSL3 precursor
• Enzymatic conversion of the single-chain INSL3 precursor into mature INSL3
• Peptide mapping of the refolded single-chain INSL3 precursor
• CD spectroscopic study
• Functional cAMP assay
• Discussion
• Acknowledgments
• References
• Materials and methods