Báo cáo khoa học: Purification and sequence identification of anserinase

Purification and sequence identification of anserinase

Tác giả: Shoji Yamada, Yoshito Tanaka and Seiichi Ando

Lĩnh vực: Faculty of Fisheries, Kagoshima University, Japan

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này báo cáo việc xác định phân tử của anserinase, một enzyme dipeptidase được tinh chế từ não của cá rô phi Nile (Oreochromis niloticus). Enzyme này chủ yếu xúc tác quá trình thủy phân Nα-acetylhistidine trong não, võng mạc và thủy tinh thể của các động vật có xương sống máu lạnh. Các tác giả đã xác định trình tự N-terminal của anserinase đã tinh chế, cho phép thiết kế các mồi để khuếch đại cDNA tương ứng bằng PCR. cDNA anserinase có một vùng mã hóa (ORF) gồm 1485 nucleotide, mã hóa một peptide tín hiệu gồm 18 axit amin và một protein trưởng thành gồm 476 axit amin với khối lượng phân tử dự kiến là 53.3 kDa. Phân tích trình tự cho thấy anserinase thuộc họ M20A metallopeptidase. Nghiên cứu cũng đã phân lập một cDNA mã hóa protein giống CNDP từ não cá rô phi. mRNA anserinase được phát hiện chủ yếu ở não, võng mạc, thận và cơ xương, trong khi mRNA protein giống CNDP được phát hiện ở tất cả các mô được kiểm tra. Phân tích đặc tính cơ chất cho thấy anserinase cá rô phi có ái lực thủy phân với Nα-acetyl-L-His, Nα-chloroacetyl-L-Leu và các dipeptide khác, thể hiện phổ cơ chất rộng.

Mục lục chi tiết:

• Keywords
• Correspondence
• Enzyme
• Note
• Abstract
• Purification and characterization of anserinase from Nile tilapia brain
• Molecular cloning of anserinase and CNDP-like protein
• Database search
• Cloning of anserinase cDNA
• Cloning of the CNDP-like protein cDNA
• Tissue distribution of the mRNAs for anserinase and CNDP-like protein in Nile tilapia
• Molecular phylogenetic analysis
• Experimental procedures
• Enzyme assay
• Protein determination
• Analytical SDS/PAGE
• Purification of brain anserinase
• Step 1: extraction
• Step 2: ammonium sulfate precipitation
• Step 3: octyl-Sepharose CL-4B chromatography
• Step 4: Superdex 200 HR gel filtration
• Step 5: Resource Q chromatography
• Step 6: preparative native PAGE
• Step 7: preparative SDS/PAGE
• N-Terminal sequence analysis and BLAST search
• Molecular cloning of Nile tilapia anserinase and CNDP-like protein cDNAs
• Isolation of a partial cDNA encoding anserinase
• Isolation of a partial cDNA encoding CNDP-like protein
• 3′ and 5′ RACE
• DNA sequencing
• Computer assisted analysis
• Tissue distribution of the mRNA for anserinase and CNDP-like protein
• Acknowledgements
• References