Báo cáo khoa học: Purification and kinetic analysis of the two recombinant arogenate dehydrogenase isoforms of Arabidopsis thaliana

Purification and Kinetic Analysis of the Two Recombinant Arogenate Dehydrogenase Isoforms of Arabidopsis thaliana

Tác giả: Pascal Rippert and Michel Matringe

Lĩnh vực: Sinh hóa học, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này báo cáo về quá trình tinh sạch và phân tích động học đầu tiên của hai dạng enzyme arogenate dehydrogenase tái tổ hợp (TyrAAT1 và TyrAAT2) từ Arabidopsis thaliana. Hai dạng enzyme này được sản xuất quá mức trong Escherichia coli và được tinh sạch tới độ đồng nhất. So sánh sinh hóa giữa hai dạng cho thấy TyrAAT1 hiệu quả gấp bốn lần TyrAAT2 ở nồng độ cơ chất thấp. TyrAAT2 biểu hiện hoạt tính prephenate dehydrogenase yếu, trong khi TyrAAT1 thì không. Nghiên cứu cũng điều tra cơ chế phản ứng của hai dạng enzyme này bằng động học trạng thái ổn định, cho thấy chúng tuân theo cơ chế ngẫu nhiên cân bằng nhanh với sự hình thành hai phức hợp chết (dead-end complexes).

Mục lục chi tiết:

• Purification and kinetic analysis of the two recombinant arogenate dehydrogenase isoforms of Arabidopsis thaliana
• Keywords: Arabidopsis thaliana; tyrosine biosynthesis; arogenate dehydrogenase; isoforms; enzymatic properties.
• Introduction
• Materials and Methods
• Engineering of expression vector
• Expression and purification of recombinant TyrAAT1
• Expression and purification of recombinant TyrAAT2
• Protein concentration
• Electrophoretic analyses of proteins
• Enzyme activities
• Data analysis
• Results
• Purification of TyrAAT1 and TyrAAT2
• Kinetic analyses
• Table 1. Purification of the two A. thaliana arogenate dehydrogenases TyrAAT1 and TyrAAT2. NTA, nitrilotriacetic acid.
• Table 2. Kinetic properties of the two purified A. thaliana arogenate dehydrogenases TyrAAT1 and TyrAAT2.
• Kinetic mechanism
• Steady-state velocity studies in the absence of product.
• Figure 4. Effects of substrate concentration on the velocity of the two arogenate dehydrogenases TyrAAT1 (upper panels), and TyrAAT2 (lower panels).
• Steady-state velocity studies in the presence of product and product or substrate analogues.
• Figure 5. Product inhibition of the two arogenate dehydrogenases TyrAAT1 and TyrAAT2.
• Discussion
• References