Báo cáo khoa học: Mg2+-modulated KMnO4 reactivity of thymines in the open transcription complex reflects variation in the negative electrostatic potential along the separated DNA strands

Mg²⁺-modulated KMnO₄ reactivity of thymines in the open transcription complex reflects variation in the negative electrostatic potential along the separated DNA strands

Footprinting of Escherichia coli RNA polymerase complex at the λP_R promoter revisited

Tác giả: Tomasz Łoziński and Kazimierz L. Wierzchowski

Lĩnh vực: Biophysics, Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, Warszawa, Poland

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này xem xét động học oxy hóa thymine bằng KMnO₄ trong phức hợp RNA polymerase mở (RPo) tại promoter λP_R. Mục đích là để làm sáng tỏ tranh cãi về cơ chế tách chuỗi DNA trong quá trình hình thành RPo, đặc biệt là vai trò của ion Mg²⁺ và nhiệt độ. Kết quả cho thấy cả hai chuỗi DNA trong vùng promoter -11 đến +2 đều tách rời hoàn toàn trong điều kiện không có Mg²⁺. Ion Mg²⁺ làm tăng tốc độ oxy hóa bằng cách sàng lọc các nhóm mang điện tích âm. Độ phản ứng của thymine và ảnh hưởng của Mg²⁺ phản ánh sự thay đổi điện thế tĩnh điện dọc theo các chuỗi DNA tách rời, phù hợp với mô hình cấu trúc hiện tại của RPo.

Mục lục chi tiết:

• Keywords
• Correspondence
• Abbreviations
• There is still a controversy over the mechanism of promoter DNA strand separation upon open transcription complex (RPo) formation by Escherichia coli RNA polymerase…
• Transcription initiation in prokaryotes involves specific recognition between the -10 and -35 conserved hexamers of the promoter DNA and RNA polymerase holoenzyme followed by large and concerted conformational changes…
• Open complex (RPo) capable of specific binding of NTP substrates and synthesis of nascent RNA [1]…
• Results
• Oxidation of the RPO-APR complex
• Fig. 1. Sequences of the APR and Pa promoters studied…
• Fig. 2. Selected KMnO₄ footprints of the melted DNA region of RPo at the APR promoter…
• The extent of thymine oxidation in the template and nontemplate DNA strands was evaluated…
• Fig. 3. Kinetics of KMnO₄ oxidation at 37 °C of thymines in the melted region of RPo at the APR promoter…
• Table 1. Pseudo-first-order rate constants (oxk) for thymine oxidation by KMnO₄ in the melted DNA region of RPo at the APR promoter…
• Fig. 4. Effect of temperature and Mg²⁺ on the rate constants of thymine oxidation by KMnO₄ in RPo at the APR promoter, in Thd and TMP…
• Table 2. Energies of activation of the KMnO₄-oxidation reaction (OxEa) of thymines in the melted DNA region in RPo at the APR promoter, and in Thd and TMP…
• Oxidation of thymine in thymidine and its nucleotides
• Fig. 5. Effect of [MgCl₂] on the kinetics of thymine oxidation by KMnO₄. In TpT (A), TMP (B), TTP (C), and in two nontemplate DNA strand regions: T+2, T+3 (●) and T-2, T-3, T-4 (■) of RPo at the Pa promoter (D)…
• Table 3. Pseudo-first-order rate constants (ok) for thymine oxidation by KMnO₄ in Thd and its nucleotides…
• Table 4. Fitted parameters of Mg²⁺-screening isotherms for KMnO₄ oxidation of thymidine nucleotides and the two groups of thymine residues in RPo-Pa…
• Fig. 6. Effect of [MgCl₂] on KMnO₄ footprint of the melted DNA region in RPo at the Pa promoter…
• Mg²⁺ effect on the kinetics of oxidation of the RPo-Pa complex
• Discussion
• Fig. 7. Comparison of oxk; values (37 °C) for thymine oxidation in RPO-APR and RPo-Pa complexes…
• Experimental procedures
• RNA polymerase
• Promoters and DNA primers
• KMnO₄ oxidation
• Thymidine and its nucleotides
• RPo at the Pa promoter
• RPo at the λP_R promoter
• Phosphorimager analysis and quantification of band intensities
• Determination of the promoter occupancy
• Acknowledgements
• References