Báo cáo khoa học: Mechanism of the reaction catalyzed by dehydroascorbate reductase from spinach chloroplasts

Mechanism of the reaction catalyzed by dehydroascorbate reductase from spinach chloroplasts

Tác giả: Taise Shimaoka, Chikahiro Miyake, and Akiho Yokota

Lĩnh vực: Sinh học phân tử, Hóa sinh

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc làm sáng tỏ cơ chế phản ứng của enzyme dehydroascorbate reductase (DHAR) từ lục lạp của cây spinach. DHAR đóng vai trò quan trọng trong việc tái tạo ascorbate, một chất chống oxy hóa thiết yếu trong thực vật, bằng cách khử dehydroascorbate (DHA) với sự tham gia của glutathione (GSH) như là donor electron. Thông qua phân tích động học enzyme, các nhà nghiên cứu đã đề xuất một cơ chế phản ứng bi-uni-uni-uni-ping-pong, trong đó sự gắn kết của DHA vào enzyme được tiếp nối bởi sự gắn kết của GSH. Các thông số động học như Km cho DHA và GSH, cùng với tốc độ chuyển hóa (turnover rate), đã được xác định. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng một gốc Cysteine (C23) trong enzyme là không thể thiếu đối với hoạt tính xúc tác của DHAR. Dữ liệu thực nghiệm cũng cung cấp bằng chứng về sự hình thành một sản phẩm trung gian giữa enzyme và GSH, và xác định vai trò của các sản phẩm phản ứng trong việc ức chế enzyme.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Experimental procedures
• Materials
• Assay of the activity of DHAR
• Analysis of data
• Purification of recombinant DHAR from Escherichia coli
• SDS/PAGE
• Western blotting
• Results and discussion
• Initial velocity and product inhibition of the reaction catalyzed by spinach chloroplast DHAR
• Detection of the oxidized form enzyme, E-S-SG
• Identification of the C residue involved in the reaction catalyzed by chloroplast DHAR
• Influence of reaction products on the activity of DHAR
• Acknowledgements
• References
• Appendix
• Mathematical representations of the kinetic model
• Determination of kinetic parameters