Báo cáo khoa học: Functional characterization of the maltose ATP-binding-cassette transporter of Salmonella typhimurium by means of monoclonal antibodies directed against the MalK subunit

Functional Characterization of the Maltose ATP-Binding-Cassette Transporter of Salmonella Typhimurium by Means of Monoclonal Antibodies Directed Against the MalK Subunit

Tác giả: Anke Stein, Martina Seifert, Rudolf Volkmer-Engert, Jörg Siepelmeyer, Knut Jahreis, and Erwin Schneider

Lĩnh vực: Biochemistry, Molecular Biology, Microbiology

Nội dung tài liệu:
Nghiên cứu này mô tả việc tạo ra và đặc tính hóa chín kháng thể đơn dòng (mAbs) chống lại tiểu đơn vị MalK của bộ máy vận chuyển ATP-binding cassette (ABC) maltose ở Salmonella typhimurium. Các kháng thể này nhận biết bốn epitope tuyến tính không chồng lấn, nằm ở cả miền N-terminal (ATPase) và miền C-terminal (điều hòa) của MalK. Nghiên cứu sử dụng các kháng thể này để điều tra các tương tác protein-protein quan trọng đối với chức năng của bộ máy vận chuyển. Các kết quả cho thấy các kháng thể nhận biết epitope ở miền N-terminal ức chế hoạt động ATPase của MalK, trong khi các kháng thể nhắm vào miền C-terminal không ảnh hưởng đến hoạt động này. Ngoài ra, nghiên cứu còn cung cấp bằng chứng cho thấy MalT và enzyme IIAGlc tương tác với miền C-terminal của MalK, ảnh hưởng đến khả năng gắn kết của các kháng thể tương ứng. Các phát hiện này góp phần làm rõ cơ chế hoạt động và điều hòa của bộ máy vận chuyển maltose ABC.

Mục lục chi tiết:

• Functional characterization of the maltose ATP-binding-cassette transporter of Salmonella typhimurium by means of monoclonal antibodies directed against the MalK subunit
• Experimental Procedures
• Preparative procedures
• Preparation of mAbs
• Isolation of Fab fragments
• Determination of isotypes
• Peptide synthesis on cellulose membranes – SPOT synthesis
• Epitope mapping
• Peptide synthesis
• ELISA
• Analytical methods
• Results
• Monoclonal antibodies recognize epitopes in the N-terminal (ATPase) domain and in the C-terminal domain of MalK, respectively
• ATP affects binding of mAbs to soluble MalK but not to MalFGK2-containing proteoliposomes
• Fab fragments of 5B5 and 4H12 only slightly inhibit ATPase activity of MalK and of proteoliposomes
• MalT interferes with binding of mAbs 4B3 and 2F9 to their epitopes
• Enzyme IIAGlc eliminates binding of mAbs 2F9 and 4B3 to the MalFGK2 complex
• Discussion
• Acknowledgements
• References