Báo cáo Y học: Expression and purification of the recombinant subunits of toluene/ o-xylene monooxygenase and reconstitution of the active complex

Expression and Purification of the Recombinant Subunits of Toluene/o-Xylene Monooxygenase and Reconstitution of the Active Complex

Tác giả: Valeria Cafaro, Roberta Scognamiglio, Ambra Viggiani, Viviana Izzo, Irene Passaro, Eugenio Notomista, Fabrizio Dal Piaz, Angela Amoresano, Annarita Casbarra, Piero Pucci and Alberto Di Donato

Lĩnh vực: Hóa sinh, Khoa học sinh học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này mô tả quá trình phân lập gen mã hóa từng thành phần của phức hợp monooxygenase toluene/o-xylene từ vi khuẩn Pseudomonas stutzeri OX1. Các gen này sau đó được biểu hiện, tinh sạch và đặc trưng hóa. Quan trọng hơn, việc tái tổ hợp các tiểu đơn vị tái tổ hợp đã tạo thành một phức hợp hoạt động, cho phép xác định vai trò chức năng của từng thành phần trong quá trình chuyển điện tử từ chất cho điện tử đến oxy phân tử. Nghiên cứu cũng làm rõ các lỗi nhỏ trong trình tự gen ban đầu và cung cấp bằng chứng thực nghiệm củng cố mô hình chuyển điện tử, trong đó tiểu đơn vị F đóng vai trò là mắt xích đầu tiên, chuyển điện tử từ NADH đến C, sau đó đến phức hợp H và cuối cùng là oxy phân tử.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and Methods
• Construction of expression vectors
• Expression of recombinant plasmids
• Preparation of the soluble fraction from transformed cells
• Purification of Tomo C
• Purification of the expression products of pET22b(+)/touBEA
• In vitro renaturation and purification of recombinant Tomo F
• Expression and preparation of recombinant apo-Tomo F
• Enzymatic assays of Tomo F reductase activity
• Multiple turnover assays for the reconstituted Tomo complex
• Single turnover assay
• Protein sequencing and mass spectrometry
• Iron and labile sulfide determination
• Extraction and identification of FAD from TomoF
• Tomo C reduction by sodium dithionite
• Separation of the subunits of the subcomplex H
• Estimation of molecular mass by gel filtration
• Other methods
• Results and Discussion
• Characterization of recombinant Tomo C
• Characterization of recombinant Tomo F
• Reconstitution of the Tomo complex from recombinant subunits
• Acknowledgements
• References