Báo cáo khoa học: Differences in substrate specificities between cysteine protease CPB isoforms of Leishmania mexicana are mediated by a few amino acid changes

Differences in substrate specificities between cysteine protease CPB isoforms of Leishmania mexicana are mediated by a few amino acid changes

Tên đề tài: Differences in substrate specificities between cysteine protease CPB isoforms of Leishmania mexicana are mediated by a few amino acid changes

Tác giả: Maria A. Juliano, Darren R. Brooks, Paul M. Selzer, Hector L. Pandolfo, Wagner A. S. Judice, Luiz Juliano, Morten Meldal, Sanya J. Sanderson, Jeremy C. Mottram, Graham H. Coombs

Lĩnh vực: Khoa học sinh học, Y sinh

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này so sánh đặc tính thủy phân cơ chất của hai dạng đồng phân của cysteine protease (CPB) từ Leishmania mexicana là CPB2.8 và CPB3, cùng với một dạng đột biến H84Y của CPB3. Mục tiêu là phân tích vai trò của một vài thay đổi axit amin trong việc xác định đặc tính nhận biết cơ chất của các dạng đồng phân này. Các kết quả cho thấy rằng sự khác biệt nhỏ về trình tự axit amin giữa các dạng đồng phân CPB là yếu tố quan trọng trong việc điều chỉnh đặc tính nhận biết cơ chất của chúng, từ đó cung cấp cho ký sinh trùng một loạt hoạt tính thủy phân cần thiết cho sự tương tác với vật chủ và đảm bảo sự tồn tại của chúng.

Mục lục chi tiết:

• Cysteine proteases (CPs) are present in almost all organisms…
• Correspondence to G. H. Coombs…
• Abbreviations…
• Cell lines (plasmids expressed in Acpb)…
• Plasmids…
• Abbreviation…
• Expressed cysteine protease…
• Comments…
• enzyme’s activity have all been postulated…
• Information about the functions and importance of the Leishmania enzymes…
• Keywords: carboxydipeptidase; cysteine protease; fluorogenic peptides; Leishmania; parasite.
• Materials and methods
• Parasites
• Molecular modeling
• Mutagenesis, constructs, transfections and production of recombinant enzymes
• Western blotting
• Synthesis of Abz-peptidyl-Q-EDDnp
• Enzymatic hydrolysis of fluorescent quenched substrates
• HPLC analysis of the enzymatic hydrolysis products of the synthetic fluorogenic substrates
• Results
• Correlation between structure and activity of CPB isoenzymes using substrate SDS/PAGE
• Fig. 1. Gelatin SDS/PAGE and Western blot analyses…
• The mutated forms of CPB3 were also assessed for activity…
• Fig. 2. Fluorogenic SDS/PAGE and Western blot analyses…
• S1 subsite specificity characterization of CPB3 and H84Y
• Table 2. Kinetic parameters for hydrolysis, by CPB, of the peptides derived from Abz-KLXFSKQ-EDDnp…
• S2 and S3 subsite specificity characterization of rCPB3 and rH84Y
• Table 3. Kinetic parameters for hydrolysis, by CPB, of the peptides derived from Abz-KLRFSKQ-EDDnp…
• S1′ to S3′ subsite specificity characterization of rCPB3 and rH84Y
• Table 4. Kinetic parameters for hydrolysis, by CPB, of the peptides derived from Abz-KLRFSKQ-EDDnp…
• Carboxydipeptidase activity of rCPB3 and rH84Y
• Fig. 3. pH-profile activity (kcat/Km) for the hydrolysis of Abz-FRAK(Dnp)-OH and Abz-FRAK(Dnp)-NH2…
• Table 5. Kinetic constant parameters for carboxydipeptidase activities…
• Analysis of amino acid locations via modelling
• Fig. 4. Homology-based protein model of the mature domain of L. mexicana CPB…
• Table 6. Key active site residues of cathepsin L-like cysteine proteases…
• Discussion
• Acknowledgements
• References