Báo cáo khoa học: Development of a baculovirus-based fluorescence resonance energy transfer assay for measuring protein–protein interaction

Development of a baculovirus-based fluorescence resonance energy transfer assay for measuring protein-protein interaction

Tác giả: Timothy C. Cheung and John P. Hearn

Lĩnh vực: Developmental Biology Research Group, Research School of Biological Sciences, The Australian National University, Canberra, Australia

Nội dung tài liệu: Bài viết này mô tả một phương pháp mới sử dụng kỹ thuật huỳnh quang cộng hưởng năng lượng (FRET) dựa trên hệ thống baculovirus (Bv-FRET) để đo lường sự tương tác giữa các protein trong tế bào sống. Phương pháp này đã được kiểm chứng hiệu quả trong việc xác định sự đa phân tử hóa của thụ thể hormone giải phóng gonadotropin (GnRH-R) trong màng tế bào. Bằng cách sử dụng protein huỳnh quang xanh (GFP) làm chất phát huỳnh quang cho và protein huỳnh quang vàng tăng cường (EYFP) làm chất nhận huỳnh quang, các nhà nghiên cứu đã có thể quan sát sự truyền năng lượng khi hai protein ở gần nhau. Hệ thống Bv-FRET được chứng minh là một phương pháp hiệu quả, đáng tin cậy và thuận tiện, khắc phục những hạn chế của các phương pháp dựa trên biến nạp tế bào truyền thống. Nó cho phép kiểm soát chính xác mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp và tỷ lệ đồng biểu hiện của các chất phát và nhận huỳnh quang, từ đó tăng cường tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu và độ nhạy của phép đo FRET. Phương pháp này có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu tương tác protein-protein và sàng lọc các phân tử mới có khả năng ảnh hưởng đến các tương tác này.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and methods
• Construction of expression plasmids
• Transfection and amplification of recombinant baculoviruses
• GnRH-R-GFP and GnRH-R-EYFP expression
• Spectral characterization of GFP and EYFP
• FRET assay
• Dimerization of GnRH receptor
• Negative controls
• Effect of GnRH analogues on the association of GnRH receptor
• Discussion
• Acknowledgements
• References