Báo cáo khoa học: Comparative importance in vivo of conserved glutamate residues in the EX7E motif retaining glycosyltransferase Gpi3p, the UDP-GlcNAc-binding subunit of the first enzyme in glycosylphosphatidylinositol assembly

Comparative importance in vivo of conserved glutamate residues in the EX₇E motif retaining glycosyltransferase Gpi3p, the UDP-GlcNAc-binding subunit of the first enzyme in glycosylphosphatidylinositol assembly

Tác giả: Zlatka Kostova, Benjamin C. Yan, Saulius Vainauskas, Roberta Schwartz, Anant K. Menon, và Peter Orlean

Lĩnh vực: Biochemistry

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào vai trò của các axit amin glutamate được bảo tồn trong motif EX₇E của enzyme Gpi3p, một tiểu đơn vị liên kết UDP-GlcNAc thiết yếu trong quá trình tổng hợp glycosylphosphatidylinositol. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp đột biến điểm để thay đổi các gốc glutamate (Glu289, Glu297) và cysteine (Cys301) trong Gpi3p của Saccharomyces cerevisiae để đánh giá tầm quan trọng của chúng đối với chức năng của enzyme trong cơ thể sống (in vivo). Kết quả cho thấy cả hai gốc glutamate đều quan trọng đối với chức năng, nhưng gốc glutamate thứ hai (Glu297) nhạy cảm hơn với các thay đổi và do đó quan trọng hơn đối với hoạt động của enzyme. Ngoài ra, đột biến Cys301 thành alanine không ảnh hưởng đến khả năng hỗ trợ sự phát triển của tế bào nhưng làm giảm hoạt động tổng hợp GlcNAc-PI in vitro, không ủng hộ giả thuyết trước đây về vai trò của cysteine trong việc liên kết UDP-GlcNAc.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and methods
• Materials
• Yeast strains and culture media
• Expression and mutagenesis of S. cerevisiae GPI3
• Cloning, disruption and site-directed mutagenesis of Sz. pombe gpi3+
• Assay of GlcNAc-PI synthesis
• Imaging and microscopy
• Results
• E289A and E297A mutants in S. cerevisiae Gpi3p
• E289D and E297D mutants in S. cerevisiae Gpi3p
• E277D and E285D mutants in Sz. pombe Gpi3p
• C301A mutant in S. cerevisiae Gpi3p
• Discussion
• Acknowledgements
• References