Báo cáo khoa học: Biochemical characterization of USP7 reveals post-translational modification sites and structural requirements for substrate processing and subcellular localization

Biochemical Characterization of USP7

Tác giả: Amaury Fernández-Montalván, Tewis Bouwmeester, Gerard Joberty, Robert Mader, Marion Mahnke, Benoit Pierrat, Jean-Marc Schlaeppi, Susanne Worpenberg, and Bernd Gerhartz

Lĩnh vực: Sinh hóa, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc mô tả chi tiết các đặc tính sinh hóa của Ubiquitin specific protease 7 (USP7), một enzyme thuộc họ deubiquitinating enzyme (DUB). USP7 đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa các con đường phản ứng với stress, quá trình methyl hóa biểu sinh và sự tiến triển của các bệnh nhiễm do virus DNA. Bài báo trình bày kết quả nghiên cứu về các vị trí sửa đổi sau dịch mã, các yêu cầu cấu trúc đối với việc xử lý cơ chất và định vị dưới tế bào của USP7. Các thí nghiệm đã xác định các vị trí phosphoryl hóa tại S18 và S963, cũng như vị trí ubiquitination tại K869 trong các tế bào động vật có vú. Các biến thể USP7 với các miền bị cắt ngắn đã được biểu hiện để phân tích trạng thái kết tụ, các đặc tính enzyme và vị trí dưới tế bào. Kết quả cho thấy miền C-terminal đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý cơ chất và có thể liên quan đến quá trình dimer hóa của enzyme. Miền N-terminal, đặc biệt là một đoạn bao gồm các axit amin từ 70-205, được chứng minh là đủ để định vị enzyme trong nhân, gợi ý rằng các đối tác tương tác có thể cần thiết cho quá trình nhập nhân của USP7. Nghiên cứu cũng làm rõ tính đặc hiệu cao của USP7 đối với ubiquitin.

Mục lục chi tiết:

• Biochemical characterization of USP7 reveals post-translational modification sites and structural requirements for substrate processing and subcellular localization
• Keywords
• Correspondence
• Ubiquitin specific protease 7 (USP7) belongs to the family of deubiquitinating enzymes.
• Deubiquitinating enzymes (DUBs) are a superfamily of thiol- and metallo proteases specialized in the processing of ubiquitin and ubiquitin-like proteins.
• Abbreviations
• Structural-functional features and constructs of USP7 designed for this study.
• Matching these predictions, limited proteolysis and X-ray crystallography disclosed amino acids 208-560 as the protease core of USP7 [20] (Fig. 1A).
• In the present study, the biochemical properties and structure-function relationships of USP7 were characterized.
• Results
• Heterologous expression and purification of functional USP7 variants
• Identification of post-translational modifications in USP7 purified from mammalian cells
• Analysis of USP7 oligomerization: possible role of the C-terminal region
• Substrate specificity and enzymatic properties of USP7
• C-terminal truncations destabilize the ubiquitin-enzyme complex
• Structural requirements for USP7 nuclear localization
• Discussion
• Experimental procedures
• Materials
• Generation of plasmids, bacmids and baculoviruses
• Expression and purification of USP7 variants
• Limited proteolysis
• Tandem affinity purification and mass spectrometric analysis of USP7
• Analytical size exclusion chromatography coupled to light scattering analysis
• Enzyme activity assays
• Mammalian cell culture and transfection
• Cell lysis, sample preparation and immunoblotting
• Immunostaining and confocal fluorescence microscopy
• Acknowledgements
• References
• Supplementary material