Biểu Hiện, Tinh Sạch Và Đánh Giá Tính Chất Của Lumbrokinase Ở Pichia Pastoris

Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của lumbrokinase ở Pichia pastoris

Tác giả: Vũ Thị Bích Ngọc

Lĩnh vực: Sinh học thực nghiệm

Nội dung tài liệu:

Luận văn Thạc sĩ Khoa học này tập trung nghiên cứu về enzyme lumbrokinase (LK), một enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao, có tiềm năng trong điều trị các bệnh liên quan đến huyết khối như nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não. Nghiên cứu nhằm mục đích góp phần vào việc hạ giá thành sản phẩm và chủ động nguồn nguyên liệu, tiến tới xây dựng quy trình công nghệ tạo các dòng tế bào sản xuất LK tái tổ hợp. Luận văn tập trung giải quyết hai vấn đề chính: 1. Sử dụng công nghệ gen và công nghệ protein để biểu hiện và tinh sạch enzyme lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin. 2. Nghiên cứu một số tính chất của enzyme LK tái tổ hợp tinh sạch được.

Mục lục chi tiết:

• Lời cảm ơn
• Mục lục
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình
• Bảng ký hiệu và các chữ viết tắt
• Mở đầu
• Chương 1: Tổng quan tài liệu
• 1.1. Tổng quan về bệnh tắc nghẽn mạch máu
• 1.1.1. Sơ lược về bệnh tắc nghẽn mạch máu
• 1.1.2. Quá trình đông máu và cơ chế tan huyết khối
• 1.1.3. Một số thuốc điều trị tắc nghẽn mạch máu
• 1.2. Khái quát về enzyme thủy phân fibrin
• 1.2.1. Một số nguồn sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin
• 1.2.2. Phân loại enzyme thủy phân fibrin
• 1.3. Khái quát về enzyme lumbrokinase
• 1.3.1. Cấu trúc và đặc tính của lumbrokinase
• 1.3.2. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase ở Việt Nam
• 1.3.3. Tình hình nghiên cứu lumbrokinase trên thế giới
• 1.4. Hệ biểu hiện Pichia pastoris
• 1.4.1. Khái quát về hệ biểu hiện Pichia pastoris
• 1.4.2. Chuyển gen ngoại lai vào genome nấm men
• Chương 2: Vật liệu và phương pháp
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.1.1. Vật liệu
• 2.1.2. Hóa chất
• 2.1.3. Các dung dịch và đệm
• 2.1.4. Môi trường
• 2.1.5. Máy móc và thiết bị
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy
• 2.2.2. Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu hiện LK tái tổ hợp
• 2.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp
• 2.2.4. Tách fibrinogen
• 2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin
• 2.2.6. Xác định hàm lượng protein
• 2.2.7. Xác định các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính và độ bền của enzyme
• 2.2.8. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
• 2.2.9. Phản ứng nối ghép gen ngoại lai
• 2.2.10. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli
• 2.2.11. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli
• 2.2.12. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.2.13. Xử lý DNA plasmid bằng enzyme cắt giới hạn
• 2.2.14. Tinh sạch DNA gel agarose
• 2.2.15. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện
• 2.2.16. Tách chiết DNA tổng số nấm men
• 2.2.17. Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS- PAGE)
• 2.2.18. Nhận dạng protein ngoại lai bằng kỹ thuật MALDI-TOF (MS/MS)
• 2.2.19. Giải trình tự nucleotide
• 2.2.20. Xử lý số liệu
• Chương 3: Kết quả và thảo luận
• 3.1. Nhân dòng gen mã hóa lumbrokinase
• 3.1.1. Thiết kế vector tách dòng pJET1.2 blunt/lk (pJLK)
• 3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pPICZaA/LK (pPLK)
• 3.2. Biểu hiện lumbrokinase trong P. pastoris X33
• 3.2.1. Tạo chủng P. pastoris X33 mang gen lk
• 3.2.2. Sàng lọc các dòng P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp
• 3.2.3. Biểu hiện P. pastoris X33/pPLK tái tổ hợp
• 3.2.4. Tối ưu môi trường biểu hiện
• 3.2.5. Tối ưu nồng độ methanol
• 3.2.6. Tối ưu thời gian biểu hiện
• 3.3. Tinh sạch rLK
• 3.4. Đánh giá tính chất của rLK
• 3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK
• 3.4.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK
• Kết luận và kiến nghị
• Phụ lục