Simultaneous Improvement Of Catalytic Activity And Thermal Stability Of Tyrosine Phenol-Lyase By Directed Evolution

Simultaneous Improvement of Catalytic Activity and Thermal Stability of Tyrosine Phenol-Lyase by Directed Evolution

Tác giả: Eugene Rha, Sujin Kim, Su-Lim Choi, Seung-Pyo Hong, Moon-Hee Sung, Jae J. Song, Seung-Goo Lee

Lĩnh vực: Industrial Biotechnology & Bioenergy Research Center, KRIBB, Daejeon, South Korea; BioLeaders Corp., Daejeon, South Korea; Molecular Bioprocess Research Center, KRIBB, JungUp, South Korea

Nội dung tài liệu:

Nghiên cứu này trình bày phương pháp kỹ thuật tiến hóa định hướng nhằm nâng cao cả hoạt tính xúc tác và độ bền nhiệt của enzyme tyrosine phenol-lyase (TPL) từ vi khuẩn Symbiobacterium toebii. Phương pháp được áp dụng bao gồm đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp các đột biến thu được. Qua các bước sàng lọc, đã xác định được các chủng đột biến có hoạt tính tăng gấp đôi và nhiệt độ bán bất hoạt tăng tới 5.6 °C. Tiếp đó, sử dụng phương pháp tái tổ hợp đột biến, đã thu được các chủng TPL với hoạt tính tăng gấp ba lần và độ bền nhiệt cải thiện tới 11.2 °C. Phân tích chuỗi cho thấy các đột biến cải thiện độ bền bao gồm A13V, E83K và T407A, trong khi các đột biến cải thiện hoạt tính có thêm T129I hoặc T451A. Đặc biệt, đột biến A13V đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường độ bền của enzyme. Mô hình hóa cấu trúc enzyme cho thấy các đột biến cải thiện độ bền chủ yếu nằm ở vùng giao diện giữa các dimer, bao gồm cả đầu N-terminus, còn các đột biến cải thiện hoạt tính nằm xa hơn, giúp giảm thiểu sự cản trở lẫn nhau, từ đó đạt được sự cải thiện đồng thời cả hai tính chất.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Keywords
• Correspondence
• Abbreviations
• Results and Discussion
• Mutagenesis and characterization of mutant enzymes
• Co-improvement of activity and thermal stability
• Extraction of structural information from the evolutionary process
• Materials and methods
• Materials
• Random mutagenesis and DNA shuffling
• Expression and screening of mutant library
• Purification and characterization
• Homology modeling and structural analysis
• Database
• Enzyme assay
• Acknowledgements
• References