Tetracysteine-tagged prion protein allows discrimination between the native and converted forms

Tetracysteine-tagged Prion Protein Allows Discrimination Between the Native and Converted Forms

Tên đề tài: Tetracysteine-tagged prion protein allows discrimination between the native and converted forms

Tác giả: Jernej Gašperšič, Iva Hafner-Bratkovič, Michel Stephan, Peter Veranič, Mojca Benčina, Ina Vorberg and Roman Jerala

Lĩnh vực: Tế bào học, Hóa sinh, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu:

Nghiên cứu này giới thiệu một phương pháp mới để tổng hợp các thuốc thử biarsenical, cho phép giám sát sự chuyển đổi của protein prion (PrP). Phương pháp này sử dụng các thẻ tetracysteine (TC) được đưa vào protein PrP ở các vị trí khác nhau. Các thẻ TC này có khả năng liên kết đặc hiệu với các thuốc thử biarsenical, tạo ra tín hiệu huỳnh quang có thể được sử dụng để phân biệt giữa dạng protein PrP tự nhiên và dạng đã chuyển đổi, đặc biệt là dạng sợi amyloid. Nghiên cứu đã phát triển một phương pháp định lượng không sử dụng protease để xác định tỷ lệ PrP đã chuyển đổi. Phương pháp này có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu các bệnh lý thoái hóa thần kinh liên quan đến protein.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Results
• Structured digital abstract
• Keywords
• Correspondence
• Production, secondary structure analysis and thermal stability of the TC tag-modified protein
• Conformational dependence of the fluorescence of the FIAsH-TC-tagged mPrPs
• A TC tag at the N-terminus or C-terminus of PrP does not prevent conversion
• Detection of TC-tagged mPrPs in cell culture
• FIAsH fluorescence discriminates native from fibrillar mPrP
• Quantitative fluorescent PrP conversion assay
• Construction of retroviral plasmids, production of retrovirions and transduction of the HpL3-4 cell line, and flow cytometry
• Cell labeling with biarsenical compounds
• Confocal microscopy
• Discussion
• Experimental procedures
• Materials
• Preparation of TC-tagged PrP constructs
• Protein expression, purification, and refolding
• Conversion to the fibrillar form of PrP
• Electron microscopy
• CD spectroscopy
• Fluorescence spectroscopy
• Conversion calculation
• Acknowledgements
• References