Báo cáo Y học: A catalytically inactive b1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III (GnT-III) behaves as a dominant negative GnT-III inhibitor

A Catalytically Inactive β1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III (GnT-III) Behaves as a Dominant Negative GnT-III Inhibitor

Tác giả: Hideyuki Ihara, Yoshitaka Ikeda, Souichi Koyota, Takeshi Endo, Koichi Honke and Naoyuki Taniguchi

Lĩnh vực: Biochemistry, Osaka University Medical School, Suita, Osaka, Japan

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này đã xác định các axit amin Asp321 và Asp323 là những axit amin thiết yếu cho hoạt động enzyme của GnT-III, đồng thời cung cấp thêm bằng chứng về tầm quan trọng của motif D-X-D trong các glycosyltransferase. Đặc biệt, nghiên cứu đã chứng minh tính hữu dụng của GnT-III không có hoạt tính xúc tác như một chất ức chế dương tính giả đối với sự hình thành bisecting GlcNAc. Phát hiện này mở ra một chiến lược mới trong việc điều chỉnh cấu trúc oligosaccharide in vivo, cho phép ức chế chọn lọc một bước glycosyl hóa cụ thể trong con đường sinh tổng hợp mà không phụ thuộc vào kỹ thuật chỉnh sửa gen. Mặc dù cơ chế hoạt động của thể đột biến âm tính giả này vẫn chưa được làm rõ, nhưng nó có thể dẫn đến khám phá các cơ chế điều hòa mới cho hoạt động của glycosyltransferase.

Mục lục chi tiết:

• Experimental Procedures
• Materials
• Construction of expression plasmids
• Site-directed mutagenesis
• Cell culture
• Protein determination
• Electrophoresis and immunoblot analysis
• DNA transfection
• Enzyme activity assays for glycosyltransferases
• Structural analysis of sugar chains
• RT-PCR
• Results and Discussion
• Comparison of the amino-acid sequence of GnT-III with snail ẞ1,4GlcNAcT and mammalian ẞ1,4GalT-1
• Site-directed mutagenesis of the conserved aspartic acid residues in GnT-III
• The possible role of Asp321 and Asp323 in the catalysis of GnT-III
• Expression of a catalytically inactive GnT-III in Huh6 cells, a hepatoblastoma cell line
• The specific suppression of endogenous GnT-III activity by expression of the catalytically inactive D323A mutant in Huh6 cells
• Blockage of a specific step, namely the formation of a bisecting GlcNAc residue, in N-glycan biosynthesis via the expression of the D323A mutant
• Conclusions
• Acknowledgements
• References