Báo cáo Y học: Tyrosine sulfation and N-glycosylation of human heparin cofactor II from plasma and recombinant Chinese hamster ovary cells and their effects on heparin binding

Tyrosine sulfation and N-glycosylation of human heparin cofactor II and their effects on heparin binding

Tác giả: Christoph Böhme, Manfred Nimtz, Eckart Grabenhorst, Harald S. Conradt, Annemarie Strathmann, and Hermann Ragg

Lĩnh vực: Hóa sinh, Công nghệ sinh học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích cấu trúc các biến đổi sau dịch mã của heparin cofactor II (HCII) từ huyết thanh người và từ tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc tái tổ hợp, cũng như ảnh hưởng của chúng đến khả năng gắn heparin. Các chuỗi oligosaccharide được tìm thấy gắn vào cả ba vị trí N-glycosyl hóa tiềm năng ở cả hai dạng protein. Các cấu trúc carbohydrate của HCII lưu thông trong máu có kiểu phức tạp, diantennary và triantennary theo tỷ lệ 6:1, với galactose được sialyl hóa >90% bằng axit N-acetylneuraminic liên kết α2→6. Khoảng 50% cấu trúc triantennary chứa một motif sLex. Fucosyl hóa α1→6 gần kề từ các tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc của HCII đã được phát hiện ở >90% các glycan diantennary và triantennary. Sử dụng kỹ thuật ESI-MS/MS, các peptide chứa tàn dư tyrosine ở vị trí 60 và 73 gần như được sulfat hóa hoàn toàn, bất kể nguồn gốc protein. Xử lý các tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc đã biến đổi gen bằng chlorate hoặc tunicamycin đã dẫn đến việc sản xuất các phân tử HCII có độ mạnh ion cao hơn khi tách khỏi heparin-Sepharose, cho thấy sulfat hóa tyrosine và glycan liên kết N có thể ảnh hưởng đến tương tác của chất ức chế với glycosaminoglycan.

Mục lục chi tiết:

• Tyrosine sulfation and N-glycosylation of human heparin cofactor II from plasma and recombinant Chinese hamster ovary cells and their effects on heparin binding
• MATERIALS AND METHODS
• Stable expression and amplification of HCII in CHO cells
• Treatment of HCII expressing CHO cells with inhibitors of N-glycosylation and tyrosine sulfation
• Purification of HCII from plasma and from recombinant CHO cells
• Reduction, carboxamidomethylation and tryptic digestion of HCII from plasma and from recombinant CHO cells
• Separation of N-glycans by Mono Q anion-exchange chromatography
• Enzymatic and chemical removal of sialic acid
• High-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection
• Reduction and permethylation of oligosaccharides
• MALDI-TOF MS
• Tandem electrospray ionization (ESI) mass spectrometry
• RESULTS
• Expression of HCII from CHO cells
• Production, purification and characterization of recombinant and plasma HCII
• Characterization of the tryptic peptides of serum-derived and recombinant HCII
• Identification of sulfated tyrosine peptides and glycosylation site occupancy in trypsin digests of serum-derived and recombinant HCII
• Detailed characterization of the N-glycans from serum and CHO cell-derived HCII
• Heparin binding properties of HCII treated with inhibitors of post-translational modifications
• ACKNOWLEDGEMENTS
• REFERENCES