Báo cáo khoa học: Characterization of phycoviolobilin phycoerythrocyanin-a84-cysteinlyase-(isomerizing) from Mastigocladus laminosus

Characterization of Phycoviolobilin Phycoerythrocyanin-α84-Cystein-lyase-(Isomerizing) from Mastigocladus Laminosus

Tác giả: Kai-Hong Zhao, Dong Wu, Lu Wang, Ming Zhou, Max Storf, Claudia Bubenzer, Brigitte Strohmann, and Hugo Scheer

Lĩnh vực: Hóa sinh, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc đặc tả một enzyme mới, dual-action, được gọi là phycoviolobilin phycoerythrocyanin-α84-cystein-lyase (PVB-PEC-lyase) từ Mastigocladus laminosus. Enzyme này xúc tác cho cả hai quá trình gắn kết cộng hóa trị phycocyanobilin vào PecA (apo-α-subunit của phycoerythrocyanin) và đồng phân hóa nó thành phycoviolobilin. Các yêu cầu về đồng yếu tố và động học enzyme đã được xem xét. Kết quả cho thấy enzyme này cần các nhóm thiol và kim loại hóa trị hai như Mg²⁺ hoặc Mn²⁺, và phản ứng được hỗ trợ bởi chất hoạt động bề mặt Triton X-100. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng PVB-PEC-lyase là một enzyme tương đối chậm với ái lực vừa phải, và quá trình tái hợp diễn ra theo cơ chế tuần tự. Phân tích thêm cho thấy sự tương tác giữa hai tiểu đơn vị PecE và PecF, với PecE đóng vai trò chính trong việc gắn kết và PecF trong việc đồng phân hóa sắc tố.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and Methods
• Overexpression of His6-PecA, His6-PecE, and His6-PecF
• Purification and conservation of His6-PecA, His6-Pece, and His6-PecF
• Typical reconstitution of PCB with His6-PecA under catalysis of His6-PecE, and His6-PecF
• Spectroscopy
• Intermediates of the enzyme reaction
• PCB and protein concentration determinations
• Results and Discussion
• Overexpression of His6-PecA, His6-PecE, and His6-PecF
• Purification and conservation of His6-PecA, His6-Pece, and His6-PecF
• Optimal conditions for α-PEC reconstitution
• Metal specificity
• Thiols
• Other factors influencing activity
• Fig. 1. The effect of different pH on the lyase/isomerase action of His6-PecE/F.
• Table 2. Temperature dependance of activity of His6-PecE and His6-PecF.
• Detergents.
• Fig. 2. Interaction of PCB with Triton X-100.
• Kinetics of enzymatic ligation/isomerization
• Fig. 4. Enzyme kinetics of the PVB-PEC-lyase.
• Action of individual subunits, PecE and PecF
• Fig. 5. Effect of individual lyase-isomerase subunits on the reaction of PCB with PecA.
• Table 3. Enzymatic parameters for the ligation/isomerization of PCB to His6-PecA, catalysed by His6-PecE/F under optimum conditions (see text).
• the phycoviolobilin-bearing chromoprotein, α-PEC [23], and neither of the two subunits alone could catalyse the reconstitution effectively.
• Table 4. Amino acid identities and Z-scores between the respective subunits of PCB-lyases and PVB-PEC-lyase from M. laminosus (Fischerella PCC 7603 [35,36], D. Wu, J.-P. Zhu, H. Scheer, K.-H. Zhao, unpublished results, GenBank AF506031) and Anabena sp. PCC7120 [37-40].
• Conclusions
• Table 5. Activites of the isomerizing PVB-PEC-lyase after reversible denaturation with 8 m urea, determined by the photochemical activity AAA ([11]) of the product mixture, relative to that of a-PEC produced in the enzymatic reaction under optimized conditions.
• Acknowledgements
• References