Báo cáo khoa học: Preventing nondesired RNA-primed RNA extension catalyzed by T7 RNA polymerase

Preventing Nondesired RNA-Primed RNA Extension Catalyzed by T7 RNA Polymerase

Tên đề tài: Preventing Nondesired RNA-Primed RNA Extension Catalyzed by T7 RNA Polymerase

Tác giả: Genoveva A. Nacheva và Alfredo Berzal-Herranz

Lĩnh vực: Sinh hóa, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này điều tra các kiểu phiên mã của 64 khuôn mẫu DNA mạch kép thẳng được tạo ra bởi T7 RNA polymerase. Các khuôn mẫu này chứa các trình tự 17 nucleotide dưới sự kiểm soát của promoter T7 tối thiểu và đại diện cho tất cả các tổ hợp nucleotide có thể có tại các vị trí +8, +10 và +11. Kết quả cho thấy hai loại khuôn mẫu khác biệt rõ rệt: loại thứ nhất tạo ra RNA dài 17 nucleotide là sản phẩm chạy trốn duy nhất có thể phát hiện được (chỉ 15% tổng số), và loại thứ hai, ngoài RNA có chiều dài đầy đủ như mong đợi, còn tạo ra các sản phẩm dài hơn 17 nucleotide. Phân tích tính tự bổ sung của các bản phiên mã chạy trốn dự kiến cho thấy những bản phiên mã từ loại khuôn mẫu đầu tiên có khả năng hình thành các cặp đôi liên phân tử ổn định với các đầu 3′ không bắt cặp bazơ. Ngược lại, khuôn mẫu loại thứ hai tạo ra các RNA có khả năng tạo ra các cặp đôi liên phân tử có lợi về mặt năng lượng với tính bổ sung ở đầu 3′, do đó tạo ra một khuôn mẫu RNA-mồi RNA. Các RNA dài 17 nucleotide được tinh sạch bằng gel, được phiên mã từ khuôn mẫu sau, khi ủ trong điều kiện phiên mã in vitro mà không có khuôn mẫu DNA, đã tạo ra các sản phẩm dài hơn. Không quan sát thấy sự kéo dài khi phân tích các sản phẩm RNA 17 nucleotide thu được từ loại khuôn mẫu đầu tiên. Nghiên cứu chỉ ra rằng chỉ một thay đổi nucleotide duy nhất trong khuôn mẫu DNA có thể chuyển đổi sản phẩm RNA từ khuôn mẫu mồi RNA thành dimer không thể kéo dài, dẫn đến sự thay đổi mạnh mẽ trong năng suất sản phẩm 17 nucleotide từ dưới 10% lên 100%. Ngoài ra, hai khuôn mẫu DNA loại B đã được kéo dài thêm hai nucleotide ở đầu 3′, tạo ra các bản phiên mã RNA về mặt lý thuyết không thể tạo thành các cặp đôi bắt cặp bazơ ở đầu 3′. Các sản phẩm có chiều dài đầy đủ của các khuôn mẫu DNA đã được sửa đổi này được chứng minh là không thể kéo dài bởi T7 RNA polymerase trong các điều kiện phiên mã in vitro tiêu chuẩn.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Keywords
• Bacteriophage T7 DNA-dependent RNA polymerase is one of the best characterized single subunit RNA polymerases
• Correspondence to A. Berzal-Herranz
• Abbreviation
• Experimental procedures
• Construction of DNA templates
• In vitro transcription reactions
• RNA-primed RNA-templated extension reactions
• Analysis of RNA self-complementarity
• Results
• Transcription patterns depend on template sequences
• Differentiation of two distinct types of templates
• Self-complementarity analysis of RNAs
• RNA extension in the absence of a DNA template
• Transformation of type B templates into type A
• Discussion
• Acknowledgements
• References