Báo cáo khoa học: Kinetic characterization, structure modelling studies and crystallization of Trypanosoma brucei enolase

Kinetic characterization, structure modelling studies and crystallization of Trypanosoma brucei enolase

Tác giả: Véronique Hannaert, Marie-Astrid Albert, Daniel J. Rigden, M. Theresa da Silva Giotto, Otavio Thiemann, Richard C. Garratt, Joris Van Roy, Fred R. Opperdoes và Paul A. M. Michels

Lĩnh vực: Hóa sinh, Sinh học phân tử, Nghiên cứu y sinh

Nội dung tài liệu: Bài báo này trình bày kết quả phân tích enzyme enolase (2-phospho-D-glycerate hydrolase) từ ký sinh trùng Trypanosoma brucei. Enolase được phát hiện trong cả hai dạng ký sinh trùng trong máu và dạng procyclic, với hoạt tính riêng cao hơn ở dạng trong máu. Enzyme này chỉ hiện diện trong bào tương. Enolase của T. brucei đã được biểu hiện trong E. coli và tinh sạch. Các đặc tính động học của enzyme biểu hiện trong E. coli tương tự với enzyme tự nhiên của T. brucei, cũng như với enolase từ thỏ và nấm men Saccharomyces cerevisiae, đặc biệt là các hằng số Michaelis (Km) và Ka cho cơ chất và Mg²⁺. Tuy nhiên, sự khác biệt về pH tối ưu, ức chế bởi Mg²⁺ dư thừa và độ nhạy cảm với các ion một hóa trị cho thấy enolase của T. brucei giống với enzyme của nấm men hơn. Phân tích trình tự amino acid và mô hình hóa cấu trúc cho thấy có một số gốc amino acid bất thường (Lys và Cys) gần vị trí hoạt động, có thể là mục tiêu tiềm năng cho thiết kế thuốc. Do đó, các nỗ lực đã được thực hiện để xác định cấu trúc ba chiều của enzyme, dẫn đến việc thu được các tinh thể enolase T. brucei có khả năng nhiễu xạ ở độ phân giải 2.3 Å.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and methods
• Construction of a bacterial expression system for T. brucei enolase
• Protein production and purification
• Thrombin cleavage of the recombinant protein product
• Protein measurements, SDS/PAGE and Western blotting
• Enzymes and substrates
• Enzyme assay and kinetic studies
• Alignment of sequences and structure modelling of T. brucei enolase
• Dynamic light scattering
• Crystallization and preliminary crystallographic analysis of T. brucei enolase
• Results and discussion
• Enolase activity in T. brucei and subcellular distribution
• Expression of T. brucei enolase in E. coli, purification of the enzyme and kinetic analysis
• Comparison of the T. brucei enolase sequence with the sequences of the corresponding protein in other organisms
• Crystallization and preliminary crystallographic analysis of T. brucei enolase
• Conclusion
• Acknowledgements
• References