Báo cáo khoa học: De novo RNA synthesis by a recombinant classical swine fever virus RNA-dependent RNA polymerase

De Novo RNA Synthesis By A Recombinant Classical Swine Fever Virus RNA-Dependent RNA Polymerase

Tác giả: Guang-Hui Yi, Chu-Yu Zhang, Sheng Cao, Hai-Xiang Wu, and Yi Wang

Lĩnh vực: Virology, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, Hubei, China

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc biểu hiện và tinh sạch protein NS5B tái tổ hợp, một enzyme quan trọng trong phức hợp sao chép của virus sốt lợn cổ điển (CSFV). Protein NS5B tái tổ hợp, thiếu miền kỵ nước ở C-terminal, đã được chứng minh là có khả năng khởi tạo tổng hợp RNA sợi đơn hoặc sợi kép một cách độc lập với mồi, không cần hoạt động của enzyme chuyển nucleotid đầu cuối. Quá trình tổng hợp RNA de novo được xác định là cơ chế ưu tiên cho sự khởi đầu tổng hợp RNA của CSFV. Nghiên cứu cũng khám phá các điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp RNA de novo, bao gồm vai trò của các ion kim loại hóa trị hai như Mg²⁺ và Mn²⁺, cũng như sự cần thiết của 3′-cytidylate trong mồi tổng hợp RNA. Khả năng tương tác đặc hiệu của protein NS5B tái tổ hợp với các khuôn RNA sợi đơn và sợi kép ở đầu 3′ cũng đã được chứng minh, cho thấy vai trò quan trọng của miền này trong quá trình sao chép virus.

Mục lục chi tiết:

• De novo RNA synthesis by a recombinant classical swine fever virus RNA-dependent RNA polymerase
• Keywords: classical swine fever virus; RNA-dependent RNA polymerase; nonstructural protein 5B; de novo RNA synthesis; RNA-binding activity.
• Classical swine fever virus (CSFV) is a small enveloped positive-strand RNA virus classified in the genus of Pestivirus…
• Materials and methods
• Plasmid constructs
• Expression and purification of recombinant CSFV NS5BA24
• SDS/PAGE and Western blot
• Preparation of RNA templates and RNA labeling
• In vitro RdRp
• Northern blot analysis
• RT-PCR and real-time quantitative RT-PCR
• Fig. 1. Expression and purification of classical swine fever virus (CSFV) NS5BA24 and NS5BA24GAA fusion proteins from Escherichia coli.
• RNA-binding activity by North-Western blot
• Results and discussion
• Expression and purification of bacterial recombinant NS5B 24 and its mutant, NS5BA24GAA
• NS5B 24 fusion protein possessed RdRp activity
• Fig. 2. RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) activity of classical swine fever virus (CSFV) NS5BA24 protein.
• Evidence of de novo RNA synthesis with either plus- or minus-strand viral RNA as template
• Fig. 3. De novo initiation of viral RNA synthesis by classical swine fever virus (CSFV) RNA-dependent RNA polymerase (RdRp).
• Optimal conditions for de novo RNA synthesis using (-)IRES as template
• Fig. 4. Effects of reaction conditions on de novo RNA synthesis with (-)IRES as template.
• Analysis of initiation of de novo RNA synthesis
• Fig. 5. Analysis of initiation of de novo RNA synthesis.
• Fig. 6. Specific interaction between classical swine fever virus (CSFV) RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) and viral RNA templates by North-Western blot assays.
• Specific interaction between CSFV RdRp and viral RNA templates
• Acknowledgements
• References