Báo cáo khoa học: Growth-associated protein of 43 kDa (GAP-43) is cleaved nonprocessively by the 20S proteasome

Growth-Associated Protein of 43 kDa (GAP-43) is Cleaved Nonprocessively by the 20S Proteasome

Tác giả: John B. Denny

Lĩnh vực: Department of Ophthalmology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, San Antonio, TX, USA

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này khám phá quá trình phân cắt protein GAP-43 (protein liên quan đến sự phát triển có khối lượng 43 kDa) bởi proteasome 20S. Kết quả cho thấy proteasome 20S, nhưng không phải 26S, có thể phân cắt GAP-43 không được gắn ubiquitin. Quá trình này tạo ra các mảnh nhỏ có thể phân giải được bằng SDS/PAGE. Các thử nghiệm ức chế chỉ ra rằng hoạt động β1 của proteasome tạo ra các mảnh có thể phân giải được, trong khi hoạt động β5 tạo ra các mảnh không thể phân giải. Điều này cho thấy quá trình phân cắt không diễn ra một cách liên tục. Các mảnh phân giải được cũng được tìm thấy trong hỗn hợp dịch mã của tế bào hồng cầu, cho thấy chúng có thể được tạo ra bởi proteasome nội tại của dịch thể này. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng GAP-43 không được gắn ubiquitin là nguồn gốc của các mảnh này khi có mặt ATP, và GAP-43 không được gắn ubiquitin là nguồn gốc khi không có ATP. Kết quả cho thấy sự phân cắt không liên tục của proteasome 20S không phải là do lỗi trong quá trình làm sạch proteasome. Các mảnh phân giải được có thể tái nhập vào proteasome và bị phân cắt thành các sản phẩm không thể phân giải, cho thấy sự khó khăn nằm ở việc chuyển các mảnh lớn trong proteasome từ hoạt động β1 sang hoạt động β5 để phân cắt thêm.

Mục lục chi tiết:

• Preparation of GAP-43 mRNA
• Generation of in vitro-synthesized [35S]methionine-labelled GAP-43
• Purification of 35S-labelled GAP-43 from translation mixtures using CaM-Sepharose 4B
• Addition of purified 20S proteasome and 26S proteasome fraction to purified 35S-labelled GAP-43
• Addition of inhibitors to mixtures containing purified 20S proteasome and 35S-labelled GAP-43
• Addition of ATP, G-actin, and CaM to 35S-labelled GAP-43 prior to the addition of 20S proteasome
• SDS/PAGE and fluorography
• Removal of radioactivity from gels and liquid scintillation counting
• Results
• Nonubiquitinated, full-length GAP-43 is cleaved by purified 20S proteasome
• Effect of inhibitors on the cleavage of GAP-43 by purified 20S proteasome
• Actin blocks the consumption, by purified 20S proteasome, of both full-length GAP-43 and the GAP-43 fragments formed in translation mixtures
• CaM blocks the consumption, by purified 20S proteasome, of both full-length GAP-43 and the GAP-43 fragments formed in translation mixtures
• CaM and G-actin block production of the major 36 kDa GAP-43 fragment in the absence of calcium
• DCI increases the level of high molecular mass GAP-43, reduces the level of the resolved fragments, but does not affect the level of nonubiquitinated GAP-43 when added to translation mixtures in the presence of ATP
• The high-molecular-mass GAP-43, observed following DCI treatment, is ubiquitinated GAP-43
• Depletion of ATP causes increased degradation of nonubiquitinated GAP-43 in translation mixtures and an increased production of the lower-molecular-mass resolved fragments, and these effects are blocked by the proteasome inhibitor, Z-LLNVa-CHO
• Discussion
• Acknowledgements
• References