Báo cáo khoa học: Expression, purification and catalytic activity of Lupinus luteus asparagine b-amidohydrolase and its Escherichia coli homolog

Expression, Purification and Catalytic Activity of *Lupinus luteus* Asparagine β-Amidohydrolase and Its *Escherichia coli* Homolog

Tác giả: Dominika Borek, Karolina Michalska, Krzysztof Brzezinski, Agnieszka Kisiel, Jan Podkowinski, David T. Bonthron, Daniel Krowarsch, Jacek Otlewski and Mariusz Jaskolski

Lĩnh vực: Hóa sinh học, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu:
Nghiên cứu này mô tả quá trình biểu hiện, tinh sạch và đặc tính hóa sinh của hai enzyme đồng đẳng có hoạt tính amidohydrolase: enzyme từ cây *Lupinus luteus* (LIA) và enzyme tương đồng từ vi khuẩn *Escherichia coli* (EcAIII). Cả hai enzyme đều được biểu hiện trong tế bào *E. coli* và đã được tinh sạch. Kết quả cho thấy cả hai enzyme đều bền nhiệt ở nhiệt độ lên tới 60 °C và thể hiện hoạt tính dipeptidase isoaspartyl cũng như hoạt tính L-asparaginase. Các thông số động học cho cả hai phản ứng enzyme đã được xác định, cho thấy hoạt tính dipeptidase isoaspartyl là hoạt tính chủ đạo. Phân tích hệ gen cho thấy mối liên hệ của các protein này với các enzyme asparaginase và aspartylglucosaminidase khác, đồng thời đề xuất phân loại chúng là các hydrolase N-terminal nucleophile. Điều này phù hợp với quan sát về sự phân hủy tự xúc tác của các protein chưa trưởng thành thành hai tiểu đơn vị, giải phóng threonine N-terminal như một gốc xúc tác tiềm năng.

Mục lục chi tiết: (Trích xuất tự động từ file gốc)
– Introduction
– Materials and methods
– Bacterial strains, plasmids, and media
– Cloning of LIA and EcAIII sequences
– Expression and purification of LIA
– Expression and purification of EcAIII
– Enzymatic assays and determination of kinetic parameters
– Electrospray-ionization mass spectrometry
– Thermostability studies
– Sequence analysis
– Results
– Expression and purification
– Mass spectrometry
– Enzyme assay and determination of kinetic parameters
– Discussion
– Acknowledgements
– References