Báo cáo khoa học: Determination of the metal ion dependence and substrate specificity of a hydratase involved in the degradation pathway of biphenyl/chlorobiphenyl

Determination of the metal ion dependence and substrate specificity of a hydratase involved in the degradation pathway of biphenyl/chlorobiphenyl

Tác giả: Pan Wang and Stephen Y. K. Seah

Lĩnh vực: Microbiology

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định sự phụ thuộc vào ion kim loại và đặc tính nhận diện cơ chất của một enzyme hydratase, đóng vai trò trong con đường phân hủy biphenyl/chlorobiphenyl. Enzyme BphH từ vi khuẩn phân hủy PCBs, Burkholderia xenoverans LB400, đã được biểu hiện và tinh sạch. Nghiên cứu sử dụng phổ hấp thụ nguyên tử và phân tích Scatchard cho thấy mỗi đơn vị enzyme chỉ liên kết một ion kim loại hóa trị hai. Enzyme thể hiện hoạt tính cao nhất khi sử dụng Mg²⁺ làm đồng yếu tố, với các cation hóa trị hai khác kích hoạt theo thứ tự Mg²⁺ > Mn²⁺ > Co²⁺ > Zn²⁺ > Ca²⁺. Phân tích động học cho thấy ion kim loại ảnh hưởng chủ yếu đến tốc độ chuyển hóa (k_cat) chứ không phải ái lực với cơ chất (K_m), điều này cho thấy vai trò xúc tác của kim loại. BphH cũng có khả năng chuyển hóa các cơ chất thay thế có nhóm methyl và clo ở vị trí thứ 5 của HPDA, tuy nhiên với hiệu quả thấp hơn đáng kể so với cơ chất không bị thay thế.

Mục lục chi tiết:

• Keywords
• Correspondence
• Abbreviations
• Fig. 1. Reaction catalyzed by HPDA hydratase. Carbon numbering of the HPDA substrate is indicated.
• Results
• Cloning, expression and purification of BphH
• General properties of BphH
• Table 1. Purification of BphH.
• Fig. 2. Coomassie-blue stained SDS/PAGE of purified BphH.
• Fig. 4. pH dependence of BphH activity.
• Number of metal ion bound per enzyme and determination of coordination number
• Metal ions affinity and kinetic constants for HPDA
• Table 2. Kinetic parameters for HPDA hydration catalyzed by BphH saturated with Mg2+ or Mn2+.
• Fig. 5. Dependence of BphH activity in varying concentrations of Mg2+ and Mn2+.
• Substrate specificity of BphH
• Table 3. Specificity of BphH towards 5-substituted HPDA substrates.
• Discussion
• Experimental procedures
• Chemicals
• Bacterial strains and plasmids
• DNA manipulation
• Purification of BphH
• Purification of catechol 2,3-dioxygenase (XylE)
• Purification of hydrolase TodF
• Preparation of HPDA and substituted HPDA and determination of extinction coefficients
• Determination of protein concentration, purity and molecular mass
• Kinetic assays and substrate specificity determination of BphH
• Determination of metal ion cofactor specificity
• Determination of number of magnesium ions bound per enzyme subunit
• Acknowledgements
• References