Xem trước tài liệu

Đang tải tài liệu...

Thông tin chi tiết tài liệu

Định dạng: PDF
Số trang: 12 trang
Dung lượng: 211 KB

Giới thiệu nội dung

Discovery and characterization of a Coenzyme A disulfide reductase from Pyrococcus horikoshii

Tác giả: Dennis R. Harris, Donald E. Ward, Jeremy M. Feasel, Kyle M. Lancaster, Ryan D. Murphy, T. Conn Mallet and Edward J. Crane III

Lĩnh vực: Hóa sinh, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này báo cáo việc phát hiện và đặc tính hóa một enzyme Coenzyme A disulfide reductase (CoADR) từ vi khuẩn ưa nhiệt hiếu khí bắt buộc Pyrococcus horikoshii. Enzyme này, được biểu hiện dưới dạng tái tổ hợp trong Escherichia coli, cho thấy hoạt tính khử disulfide CoA hiệu quả. Khác với các enzyme tương tự đã biết, CoADR từ P. horikoshii có khả năng sử dụng cả NADH và NADPH làm chất nền khử, mặc dù có ái lực cao hơn đối với NADPH. Nghiên cứu cũng khám phá vai trò tiềm năng của enzyme này trong việc duy trì môi trường nội bào có khả năng khử, đặc biệt ở các sinh vật hiếu khí cực đoan. Các kết quả cho thấy enzyme này có thể đóng góp vào sự cân bằng redox trong môi trường khắc nghiệt mà P. horikoshii sinh sống.

Mục lục chi tiết:

  • Introduction
  • Results
  • Characterization of the recombinant CoADR
  • CoADR activity of the recombinant P. furiosus CoADR homologue
  • Steady-state kinetics of the CoADR and oxidase reactions
  • Thermostability and thermoactivity of the CoADR
  • Anaerobic reduction with NAD(P)H and redox state of the proposed cysteine nonflavin redox center
  • Determination of free thiol content
  • Determination of CoA levels and relative stability in P. furiosus
  • Discussion
  • Physiological role of CoADR and NAD(P)H in Pyrococcus
  • Comparison of the phCoADR to the pyrococcal NADH oxidase
  • Experimental procedures
  • Growth of microorganisms
  • Cloning and expression of the gene encoding the P. horikoshii and P. furiosus CoADRs
  • Production and purification of recombinant phCoADR
  • Production and assay of the recombinant pfCoADR
  • Standard assays
  • Protein and enzyme-bound FAD extinction coefficient determinations
  • Quaternary structure determination
  • Determination of enzyme free and released thiols
  • Thiol stability assays
  • Thermostability and thermoactivity assays
  • Anaerobic titrations
  • Detection of thiols in P. furiosus
  • Acknowledgements
  • References