Báo cáo khoa học: Adaptation of intronic homing endonuclease for successful horizontal transmission

Adaptation of intronic homing endonuclease for successful horizontal transmission

Tác giả: Sayuri Kurokawa, Yoshitaka Bessho, Kyoko Higashijima, Mikako Shirouzu, Shigeyuki Yokoyama, Kazuo I. Watanabe và Takeshi Ohama

Lĩnh vực: Sinh học phân tử, Di truyền học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này khảo sát đặc tính nhận diện của enzyme nội gen I-CsmI, một loại enzyme nội gen homing được mã hóa trong một intron nhóm I thuộc gen COB của tảo lục đơn bào Chlamydomonas smithii. Enzyme nội gen homing đóng vai trò thiết yếu trong việc truyền ngang của intron nhóm I, cho phép chúng tự nhân lên bằng cách cắt DNA đích trong bộ gen của vật chủ. Nghiên cứu đã biểu hiện và tinh sạch ba loại polypeptide I-CsmI bị cắt ngắn N-đầu, và đánh giá hiệu quả cắt của chúng trên 81 cơ chất chứa các đột biến thay thế nucleotide đơn lẻ. Kết quả cho thấy I-CsmI có xu hướng cắt các cơ chất chứa thay đổi axit amin im lặng hoặc được dung nạp hiệu quả hơn các thay đổi không im lặng hoặc không được dung nạp. Nghiên cứu cũng xem xét lại các đặc tính nhận diện đã được công bố của các enzyme I-SpomI, I-Scal, và I-SceII, phát hiện sự thích nghi của chúng đối với sự biến đổi trình tự đích. Dựa trên các kết quả này, các tác giả đề xuất rằng các enzyme nội gen homing thích nghi để nhận diện các trình tự đích có thể xuất hiện ở nhiều loài, tuy nhiên sự thích nghi này giảm dần theo thời gian sau khi intron xâm nhập vào vật chủ mới.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Keywords
• Correspondence
• Abstract
• Group I introns are thought to be self-propagating mobile elements…
• Various molecular phylogenetic analyses suggest that group I introns…
• Abbreviations
• Recognition ambiguity of intronic homing endonucleases
• The distribution of group I introns is strongly biased…
• Activity of the N-terminal truncated I-Csml polypeptides
• Three N-terminally truncated I-Csml polypeptides…
• Fig. 1. Schematic of open reading frames that encode whole I-Csml…
• Essential target region
• Digestion was not observed using pC-18nt and pC-20nt…
• Cleavage point and mutational analysis of cleavable sequences
• The precise cleavage site on each strand was determined…
• Fig. 2. Effects of pH, Mg2+, Na+ and temperature on the substrate cleavage reaction…
• Table 1. Kinetic properties of intronic LAGLIDADG endonucleases.
• Fig. 3. Mutational analyses of the recognition efficiency by recombinant homing enzymes I-Csml(200) and I-Csml(217).
• Fig. 4. Cleavage pattern of linearized substrates containing single base substitutions by I-Csml(200).
• Correlation between the type of amino acid substitution and cleavage efficiency
• We analyzed whether there is any correlation between the type of amino acid substitution…
• Substrates containing a silent or tolerated amino acid change
• Seven of 48 substrates contained a silent amino acid change…
• Substrates containing a nonsilent or nontolerated amino acid change
• Forty-one of 48 substitutions caused nonsilent/nontolerated amino acid changes…
• Table 2. Type of amino acid substitution contained in the substrate and the cleavage efficiency.
• Discussion
• The original I-CsmI ORF is fused with the preceding exon…
• Experimental procedures
• Cloning and expression of wild type and N-terminally truncated I-Csml ORFs
• The entire COB gene and the alpha intron were amplified…
• Expression and purification of whole or truncated I-Csml polypeptides
• Cultures containing whole or truncated ORFs were undertaken…
• Reaction conditions to estimate the minimum target-site length
• Substrate DNA
• Chemically synthesized DNA fragments, which consist of 18, 20, or 24 nt…
• Reaction conditions
• Linearized substrate (1.5 µg) described above was added to 50 µL of the reaction mixture…
• Reaction to determine the cleavage point and its terminal shape
• We determined the terminal shape of the substrate following the T4 DNA polymerase method…
• Reaction conditions used to investigate the effect of Na+, divalent cations, pH, and temperature
• Substrate DNA fragment
• A 1.8 kb DNA fragment, containing the entire COB gene of C. reinhardtii…
• Reaction mixture
• A 50 µL reaction mixture [25 mm NaCl, 5 mM MgCl2…
• Assay of cleavable DNA sequences
• A limited part of the C. reinhardtii COB gene, which is 104 nt long…
• Reaction conditions to measure the kinetic parameters
• Linearized PCOB1.8Kb and a plasmid containing the N-terminally truncated homing endonuclease…
• Acknowledgements
• We thank Professors Yoshihiro Matsuda (Kobe University)…
• References