Báo cáo khoa học: Lot6p from Saccharomyces cerevisiae is a FMN-dependent reductase with a potential role in quinone detoxification

Lot6p From Saccharomyces Cerevisiae Is A FMN-Dependent Reductase With A Potential Role In Quinone Detoxification

Tác giả: Sonja Sollner, Ruth Nebauer, Heidemarie Ehammer, Anna Prem, Sigrid Deller, Bruce A. Palfey, Günther Daum and Peter Macheroux

Lĩnh vực: Hóa sinh

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này báo cáo việc xác định Lot6p (YLR011wp), một enzyme reductase quinone hòa tan đầu tiên từ sinh vật đơn bào Saccharomyces cerevisiae. Các nghiên cứu về định vị enzyme cho thấy Lot6p tích tụ trong tế bào chất của tế bào nấm men. Mặc dù chỉ có 23% tương đồng với enzyme reductase quinone loại 1 ở người, Lot6p thể hiện các đặc tính sinh hóa tương tự. Enzyme này xúc tác cho quá trình khử hai electron của một loạt các cơ chất quinone tự nhiên và nhân tạo, sử dụng NADH hoặc NADPH. Cơ chế động học của enzyme tuân theo một sơ đồ phản ứng ping-pong bi-bi. Các thí nghiệm in vivo cho thấy hoạt động của Lot6p phù hợp với kiểu hình của cả chủng Alot6 và chủng quá biểu hiện Lot6p, gợi ý rằng Lot6p có thể đóng vai trò trong việc kiểm soát stress oxy hóa ở nấm men.

Mục lục chi tiết:

• Keywords
• Correspondence
• Abstract
• Introduction
• Results
• Subcellular localization of Lot6p
• Isolation of Lot6p-His6
• Enzymatic properties of Lot6p
• Influence of Lot6p on quinone toxicity
• Discussion
• Experimental procedures
• Reagents
• Strains
• Preparation of subcellular fractions and protein analysis
• Microscopic inspection
• Construction of GFP-Lot6p fusions
• Cloning of LOT6 for large scale expression in E. coli and for yeast overexpression
• Expression and purification of S. cerevisiae Lot6p-His6
• Influence of Lot6p on quinone toxicity
• Steady-state kinetic studies
• Spectrophotometric methods
• Photoreduction
• Determination of redox potential
• Inhibition of Lot6p activity by dicoumarol and Cibacron Marine
• Titration of apoprotein with FMN
• Acknowledgements
• References