Xem trước tài liệu

Đang tải tài liệu...

Thông tin chi tiết tài liệu

Định dạng: PDF
Số trang: 18 trang
Dung lượng: 2 MB

Giới thiệu nội dung

Mechanistic Aspects and Redox Properties of Hyperthermophilic L-Proline Dehydrogenase from Pyrococcus furiosus Related to Dimethylglycine Dehydrogenase/Oxidase

Tác giả: Phillip J. Monaghan, David Leys and Nigel S. Scrutton

Lĩnh vực: Biochemistry, Enzyme Kinetics, Protein Chemistry

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này trình bày chi tiết về đặc tính động học và oxy hóa khử của L-proline dehydrogenase (PRODH) siêu nhiệt từ Pyrococcus furiosus. Protein này, được biểu hiện tái tổ hợp trong E. coli và tinh sạch, là một flavoprotein dehydrogenase xúc tác oxy hóa các amine bậc hai như L-proline, L-pipecolic acid và sarcosine, với hoạt tính tối ưu đối với L-proline. Holoenzyme chứa FAD, FMN và ATP. Các nghiên cứu về sự phụ thuộc pH đã được thực hiện, cho thấy mối quan hệ hình chuông đối với kcat/Km và mối quan hệ hình sigmoidal đối với kcat. Cấu trúc tinh thể sơ bộ cho thấy các gốc hoạt động quan trọng, và các nghiên cứu đột biến đã loại trừ vai trò của một số gốc nhất định trong cơ chế carbanion. Tiềm năng trung gian của FAD gắn trên enzyme phụ thuộc tuyến tính vào nhiệt độ, và được ngoại suy thành -407 ± 5 mV ở nhiệt độ sinh lý của P. furiosus. Các phát hiện này cung cấp hiểu biết chi tiết đầu tiên về động học và các thuộc tính oxy hóa khử của PRODH siêu nhiệt này, với những hàm ý về cơ chế hoạt động của nó.

Mục lục chi tiết:

  • Abstract
  • Keywords
  • Correspondence
  • Introduction
  • Results
  • Analysis of α and β subunit sequences
  • Purification of recombinant enzyme and general properties
  • Holoenzyme cofactor content
  • Redox potential of the enzyme-bound FAD at physiologic temperature
  • Discussion
  • Concluding remarks
  • Experimental procedures
  • Cloning and expression of genes encoding a novel flavoenzyme amine dehydrogenase
  • Anaerobic expression and partial purification of wild-type PRODH
  • N-terminal protein sequence analysis and MS
  • Preparation of anaerobic samples
  • Identification of flavin cofactor in PRODH
  • Optical titrations with reducing substrates and steady-state kinetic analysis
  • Product identification and quantification
  • Redox potentiometry
  • Structure determination
  • Materials
  • Acknowledgements
  • References
  • Supplementary material