Báo cáo khoa học: Molecular modeling and functional characterization of the monomeric primase–polymerase domain from the Sulfolobus solfataricus plasmid pIT3

Molecular modeling and functional characterization of the monomeric primase–polymerase domain from the Sulfolobus solfataricus plasmid pIT3

Tác giả: Santina Prato, Rosa Maria Vitale, Patrizia Contursi, Georg Lipps, Michele Saviano, Mosé Rossi, and Simonetta Bartolucci

Lĩnh vực: Sinh học phân tử, Tin sinh học, Hóa sinh, Vi sinh vật học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này trình bày phân tích cấu trúc và chức năng của một miền primase-polymerase đơn phân từ plasmid pIT3 của Sulfolobus solfataricus. Miền N-terminal của protein RepA (Rep245) đã được mô hình hóa dựa trên cấu trúc tinh thể của miền primase-polymerase hai chức năng từ plasmid archaea pRN1 và được tinh chỉnh bằng động lực học phân tử. Protein Rep245 được biểu hiện và tinh sạch, hoạt động tổng hợp axit nucleic của nó đã được đặc trưng. Nghiên cứu này mô tả hoạt động polymerase, bao gồm các đặc tính sinh hóa như pH, nhiệt độ tối ưu và sự phụ thuộc vào kim loại hóa trị hai. Ngoài ra, miền Rep245 còn thể hiện hoạt động transferase nucleotidyl cuối, có khả năng kéo dài các oligonucleotide tổng hợp theo cách không có khuôn mẫu. Phân tích so sánh trình tự-cấu trúc với các primase-polymerase archaea khác đã tiết lộ các đặc điểm riêng biệt có thể giải thích cho hoạt động đa năng của miền này. Nghiên cứu này xác định Rep245 là miền chức năng ngắn nhất từ một plasmid crenarchaeal được biết đến, có khả năng tổng hợp DNA và RNA cùng với hoạt động transferase cuối.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Keywords
• Correspondence
• A tri-functional monomeric primase-polymerase domain encoded by the plasmid pIT3 from Sulfolobus solfataricus strain IT3 was identified using a structural-functional approach.
• In all cell types, chromosomal DNA replication is a complex process entailing three enzymatic activities: helicase activity for double-helix unzipping and primase and DNA polymerase for RNA primer de novo synthesizing and elongation respectively [1,2].
• Results
• Homology modeling and structure-sequence analysis
• Structure-based sequence alignment of Rep245 prim-pol domain (31-245).
• Expression and protein purification
• Biochemical characterization of Rep245 DNA polymerase activity
• Effects of pH, divalent cations and temperature on Rep245 polymerase activity.
• Rep245 can synthesize RNA and DNA primers
• Rep245 performs 3′-terminal nucleotidyl transferase activity
• Discussion
• Experimental procedures
• Materials
• Homology modeling and MD calculations
• Construction of bacterial expression plasmids
• Expression and purification of the deletion proteins
• DNA substrates
• DNA polymerase activity
• Determination of pH and divalent ion optima for polymerase activity
• Thermophilicity and thermostability
• Primase activity
• Terminal transferase activity
• CD spectrum
• Acknowledgements
• References