Báo cáo khoa học: Structure and function of N-acetylglucosamine kinase Identification of two active site cysteines

Structure And Function Of N-acetylglucosamine Kinase

Tác giả: Markus Berger, Hao Chen, Werner Reutter and Stephan Hinderlich

Lĩnh vực: Sinh hóa học phân tử, Enzyme học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này mô tả việc xác định hai cysteine tại vị trí hoạt động của enzyme N-acetylglucosamine kinase (GlcNAc kinase) thông qua kỹ thuật đột biến định hướng và dự đoán cấu trúc dựa trên máy tính. Chuột N-acetylglucosamine kinase chứa sáu dư lượng cysteine, tất cả đều được biến đổi thành serine. Mức độ giảm hoạt tính enzyme mạnh nhất được tìm thấy ở các thể đột biến C131S và C143S. Các đặc tính động học của các thể đột biến cysteine cho thấy hoạt tính enzyme giảm là do ái lực giảm mạnh đối với N-acetylglucosamine hoặc ATP. Dự đoán cấu trúc bậc hai của N-acetylglucosamine kinase cho thấy sự tương đồng cao với glucokinase. Mô hình cấu trúc ba chiều của N-acetylglucosamine kinase dựa trên cấu trúc đã biết của glucokinase đã được tạo ra, xác nhận rằng cả hai cysteine đều nằm trong vị trí hoạt động và có vai trò tiềm năng trong cơ chế xúc tác.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and Methods
• Enzyme assays
• Site directed mutagenesis
• Expression of GlcNAc kinase and mutants in E. coli
• Western blot analysis
• Multiple sequence alignment
• RESULTS
• Construction of cysteine mutants and functional expression in E. coli BL21
• Kinetic characterization of GlcNAc kinase and cysteine mutants
• Structure prediction of GlcNAc kinase
• DISCUSSION
• ACKNOWLEDGEMENTS
• REFERENCES